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- XY-TE-0998
- 2025年11月22日
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- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
两年
- 英文名：
Bacillus subtilis WB600
- 库存：
900
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
枯草杆菌 WB800N 是芽胞杆菌属的一种，属于分泌型宿主菌，常被用于 基因表达。本产品具有新霉素（neomycin）抗性。其基因型如下：nprE aprE epr bpr mpr :: ble nprB :: bsr vpr wprA :: hyg cm :: neo; NeoR。
WB600枯草宿主菌菌种运输及保存：
低温运输，-80℃保存，有效期一年。
自备试剂：LB 培养基、山梨醇、甘露醇、甘油、超纯水等
WB600枯草宿主菌菌种使用方法
质粒转化枯草杆菌的方法有很多，如电转化、Spizizen 转化、原生质体 转化等。根据实验方法的不同，用的试剂和培养基有所不同。本手册提供一个 电转化方法。
1. 准备所需试剂与耗材：
1) 配制 40 mL（LB+0.5 M 山梨醇）:蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5g/L， NaCl 10 g/L，3.6g 山梨醇 pH=7.2。
2) 200 mL 电转培养基（0.5 M 山梨醇，0.5 M 甘露醇，10%甘油）： 18g 山梨醇，18.5g 甘露醇，20 mL 甘油。
3) 10 mL RM（0.5M 山梨醇，0.38M 甘露醇）：0.9g 山梨醇，0.7g 甘露醇。
4) 2 个 50mL 离心管，灭菌。
2. 接种枯草杆菌 WB800N 于 3 mL 的 LB 培养基中，过夜培养。
3. 取 2.6 mL 过夜培养物接入 40 mL（LB+0.5 M 山梨醇）中，37℃，200 rpm 培养至 OD600=0.85~0.95。
4. 将菌液冰水浴 10 分钟，然后 5000g，4℃离心 5 分钟收集菌体。
5. 用 50 mL 预冷的电转培养基（0.5 M 山梨醇，0.5 M 甘露醇，10%甘油）， 重新吹悬菌体，5000g，4℃离心 5 分钟去上清，如此漂洗 4 次。
6. 将洗涤后的菌体吹悬于 1 mL 电转培养基中，每 EP 管分装 60 μL。
7. 将 60 μL 感受态细胞中加入 50 ng DNA（1~8 μL），冰上孵育 2 分钟， 加入预冷的电转杯（1 mm）中，电击一次。电转仪设置：2.0 kv，1 mm， 电击 1 次。（电击结果：时间常数=4.5~5.0 ms，如果时间常数<4.2， 则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更 高的转化效率。）
8. 电击完毕取出杯子并立即加入 1 mL RM（LB+0.5 M 山梨醇+0.38 M 甘 露醇），37℃，200 rpm，复苏 3 小时后，涂板。37℃，过夜培养。
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文献和实验、遗传操作相对困难、外源蛋白有时得不到有效的表达等等。但AtaGenix却能成功避免以上问题使外源目标蛋白在枯草芽孢杆菌表达系统中有效表达，这主要得益于以下三个方面的优势： 1 丰富的表达宿主 由于枯草芽孢杆菌没有明显的密码子偏爱性，表达外源蛋白时无需对DNA序列进行优化。在不同宿主中表达时，蛋白表达情况可能有差异。在AtaGenix拥有的多种枯草芽孢杆菌表达宿主中，1012 wild type宿主菌是最常用到的，可作为胞内和胞外表达的通用菌；168
将离心后上清转移至吸附柱中，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液； 07 可选：向吸附柱中加入500 μl Buffer PD（富含蛋白酶），12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液； 注意：此步对富含内源核酸酶的宿主菌（endA+）是必须的，对于endA-宿主菌可省略。 08 向吸附柱中加入600 μl Wash Buffer（加入无水乙醇），12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液； 09 重复步骤
产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。（三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。（四）诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。2、按1∶50比例稀释
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