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- xuanya
- 美国/中国
- XY-TE-0749
- 2025年11月22日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
两年
- 英文名：
Two-Tube RT-PCR Kit
- 库存：
900
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
本试剂盒是整合 cDNA 第一链合成试剂和即用型 PCR 试剂而得的 RT-PCR 试剂盒。cDNA 第一链合成反应和 PCR 反应分别在两个离心管中进行。本试剂盒具有下列特点：
1. 即开即用，足够 50 次 RT 反应（20 uL 体系）和 600 次 PCR 反应（30 uL 体系）。
2. cDNA 第一链合成试剂盒可灵活选用随机引物、Oligo dT 引物或基因专一引物，适合各种情况。
3. PCR 试剂盒具有即用、简单等优点，PCR mix 中含上样染料，所以 PCR 产物可以直接上样电泳。
4. 两管式操作，RT 和 PCR 在不同试管中进行，便于单独优化 RT 反应或 PCR 反应条件。
5. 扩增效率高, 最长可扩增 5 Kbp 以上的 RNA。
两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)运输及保存：
低温运输,-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂：样品 RNA、模板专一正向和反向引物。
两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)使用方法
一、样品 RNA 的制备（本试剂盒不提供相关试剂）
1、可用自本公司各种 RNA 提取方法提取样品的 RNA，也可以选用其他供应商的产品，但得到的 RNA 一定要溶解在 RNase-free 的超纯水中。
两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)二：RT（逆转录）反应合成 cDNA
1. 按下表配制 RT 反应体系（20 uL 体系）:
RNA 模板
总 RNA 100-500 ng
或 poly(A) mRNA 10-500 ng
或专一的 RNA（如体外转录制备的） 0.01 pg-500 ng
引物
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL
或随机引物(0.2 ug/uL) 1 uL
或自备模板专一反向引物(10 pmol/uL) 1-2 uL
RNase-free 水 补水到 12 uL
两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)注意：RNA 样品不能含有基因组 DNA 污染。随机引物与 RNA 模板的比例将决定cDNA 合成的平均长度（成反比）。一般情况下随机引物效率好于 OligodT 引物，但如果只想转录总 RNA 中的 mRNA（只占 5%左右），则可优先选用 OligodT 引物，这样就可以排除非 mRNA 的干扰。
2. 70℃保温 5 分钟变性模板后立即冰浴。
3. 按顺序加入 6 uL RT Buffer（含 dNTP）和 2 uLMMLV 逆转录酶（含 RI），反应终体积为 20 uL。
4. 42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。
5. 70℃保温 10 分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。
6. 合成的 cDNA 可以直接作为 PCR 模板使用，不需要纯化。剩余样品可以放置在-20℃长期保存。
两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)三、PCR（30 uL 体系）
1、将全部专用染料加入到 PCR MagicMix 3.0 中，轻柔颠倒混匀即可使用。未用完的部分需要在-20℃。也可以不加专用染料，但在 PCR 结束后，电泳上样前，则需要加入电泳上样液，否则电泳时没法判断电泳速度。
2、在 PCR 管中加入下列成分：
成分 加入量
PCR MagicMix 3.0（已加染料） 15 uL
cDNA 样品（上步的 RT 反应液） 1-5 uL
模板专一性正向引物(10 pmol/uL) 1-2 uL
模板专一性反向引物(10 pmol/uL) 1-2 uL
补水到 30 uL
两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)注意：cDNA 也可以稀释后用作 PCR 模板。是否稀释或稀释多少倍完全取决于靶基因的丰度。
2、PCR 反应参数(需要根据模板和引物决定，下面的只做参考)：
过程 温度 时间
预变性 94℃ 5 min
PCR 反应（35 个循环） 94℃ 1 min
55℃ 1 min
72℃ 2 min
最后延伸 72℃ 10 min
两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)四、电泳检测
1、取 5-0 uL PCR 产物直接在 PAGE 或琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注：本试剂盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上样，不需要额外再加电泳上样液。
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文献和实验for both DNA sample and reaction mixture preparation, is strongly recommended.The reagents for PCR should be prepared separately and used solely for this purpose. Autoclaving of all solutions, except dNTPs, primers and Taq DNA Polymerase is recommended
DNA聚合酶Taq Plus和 Taq Plus I 有什么区别吗？对PCR结果有影响吗？ Taq Plus 集扩增效率高和保真度好于一体。能有效地扩增10 kb以下的片段，扩增效率比Pfu高，保真度 Taq Plus 比Taq好。对于有些结构复杂的模板，如GC含量高、有二级结构等可选用Taq Plus扩增。 Taq
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