DNA Shuffling试剂盒产品及特点: DNAShuffling即DNA分子的体外同源重组,它是一种分子水平上的定向进化(directedevolution)技术,它以一个或多个基因为起始材料,通过先随机断裂成小片段,再进行互为模板和引物的PCR(无外加引物),最后再进行常规PCR(外加引物)等处理,最后得到含有大量DNA重组突变的PCR产物。其原理示意图如下:
DNA Shuffling试剂盒本产品就是根据上述原理优化改进而成,它具有下列特点: 1.即开即用,用户只需要提供样品DNA模板,无需单独准备各成分。 2.可以用于对长度在1000bp的同源片段进行shuffling。 3.操作手册经过优化,1-2天即可完成,节省大量优化时间。 4.本产品足够10次DNAShuffling反应,只适用于科研,不能用于临床。
DNA Shuffling试剂盒运输及保存: 低温运输,-20℃保存,保存期限一年。 自备试剂:待突变基因片段、DNAShuffling引物(第二轮PCR引物)、胶回收试剂盒。
DNA Shuffling试剂盒使用方法 1.提前开启37℃和75℃水浴或金属浴。 2.待突变基因片段的制备:待突变基因片段可以用多个含同源片段的质粒为模板、用PCR法或酶切法制备。制备时需保证含起始同源片段(或此同源片段的一部分)的DNA片段总长度要比DNAshuffling终产物(第二轮PCR产物)长200-400bp,即第二轮PCR的引物位置要在此步模板制备引物内侧100-200bp,第二轮PCR产物的长度在1000bp以下。每次DNAShuffling实验至少需要2μg起始同源片段(如果含两个以上同源片段,则彼此的比例为1:1:1),最多可以使用5μg起始同源片段,并且必须通过胶回收的方法回收,以便彻底去除残留的质粒模板、引物和非特异扩增产物等(如果不去除此步的引物,其将对后续PCR造成严重干扰)。最后需用分光光度法准确定量,此溶液即为同源片段,放冰上待用。 3.准备DNaseI工作液,将1μL本试剂盒提供的DNaseI溶液、8uL超纯水、1μLDNAShuffling试剂盒溶液A混合得DNase工作液,放冰上待用。DNase工作液必须现配现用。 4.设置同源片段碎片化反应:在一个PCR管中,按顺序加入下列成分:
5.充分轻柔吹打混匀后37℃水浴8分钟,然后立即放75℃水浴处理10分钟以灭活DNaseI。 6.在2-3%琼脂糖凝胶上电泳,用常规的胶回收法回收25-150bp范围的所有片段,分光光度法精确测定回收片段的浓度。此即为回收片段,放冰上待用。 DNA Shuffling试剂盒注意:一定要加合适的DNAmarker以便确定片段范围。 7.回收片段重组反应:在一干净PCR管中加入0.5μg回收片段、50μLPCRMix3.0、补加超纯水到100μL。反应总体积为100μL8.按下面的PCR反应参数进行第一轮无引物PCR: