一步法荧光定量RT-PCR试剂盒（探针法)

特别提示：包括一步法荧光定量RT-PCR试剂盒（探针法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：一步法荧光定量RT-PCR试剂盒（探针法)
英文名称：Quant One Step qRT-PCR Kit（Probe)
产品货号：WH0102
产品规格：50μl×50次

本试剂盒是采用探针法（TaqMan,Molecular Beacon等)进行Real Time One Step qRT-PCR的专用试剂。使用本制品进行Real Time One Step qRT-PCR反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，并能有效防止污染。本反应体系由于可以对扩增产物进行实时检测，大大提高了检测灵敏度，并省略了PCR反应后的电泳步骤，非常适合于微量RNA的检测。

本试剂盒中使用了zuì适合于Real Time qRT-PCR的反转录酶Quant RTase和Hotmaster Taq DNA polymerase，保证了Real Time One Step qRT-PCR能稳定、高效的进行。Quant RTase是一种由工程菌进行重组表达的全新高效逆转录酶，具有与RNA高亲和性的特点，其能通读GC含量高、二级结构复杂的RNA模板，而Hotmaster Taq DNA Polymerase利用抑制剂通过温度调节方式封闭Hotmaster Taq DNA Polymerase的底物结合位点，温度低于40℃时，形成非活性的酶-抑制剂复合物，当温度升高至引物特异性的退火温度时，结合平衡向模板-特异性引物复合物形成方向移动，因此zuì大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧光定量PCR反应的精确性。

本试剂盒适用于探针一步法Real Time RT-PCR，可以准确简便的进行mRNA表达分析，尤其适合微量RNA的检测，适用于各种类型荧光定量PCR仪。本试剂盒可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对多种高低丰度的靶基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。

产品特点：
·可以快速、准确地对RNA病毒等微量RNA进行分析。
·在一管内连续完成反转录和定量PCR扩增，减少了多重操作污染的可能性。
·高效的反转录酶和热启动聚合酶保证扩增的高效率和高特异性。
·操作简便快速，减少加样过程中的体积损耗，保证结果的可信性。
·实验结果稳定、重复性好。

试剂盒组成：

组分	50μl×50次
2×Quant One Step RT-qPCR Mix（Probe)*	1.3ml
Hotmaster Taq Polymerase （2.5U/μl)	130μl
Quant RTase （for one step)	40 μl
RNase-Free ddH2O	2×1 ml

*内含dNTP Mixture、One step Probe RT- qPCR buffer、和ROX Reference Dye等。
储存条件：-20℃避光保存

适用的Real Time PCR扩增仪：
ABI PRISM 7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast
Real-Time PCR System （Applied Biosystems)
OPTICONTM/CFX96 （BIORAD)
Light Cycler480 （Roche)
Smart Cycler?
System （Cepheid)
Mx3000 P/Mx3005P （Stratagene)
Line-Gene （Bioer，杭州博日)
其他各种Real Time PCR扩增仪

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1．当同时需要进行数次Real Time One Step RT-qPCR反应时，应先配制各种试剂的混合液（其中包括2×Quant One Step RT-qPCR Mix （Probe)、RNase-free ddH2O、HotmasterTaq polymerase、Quant RTase、Primers、Probe等），然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。
2．使用2×Quant One Step RT-qPCR Mix （Probe)时，应轻轻混匀，避免起泡，并在分取时慢慢吸取。
3．保存2×Quant One Step RT-qPCR Mix （Probe)或配制Real Time One Step RT-qPCR反应液时应避免强光照射。
4．反应液的配制、分装时请一定使用新的（无污染的）枪头或带滤心枪头、Microtube等，尽量避免污染。
5．制品只能使用特异性反转录引物，不能使用Random Primer和Oligo dT Primer等进行反转录反应。

操作步骤：
1．按下列组份配制50μl体系的RT-qPCR反应液（反应液配制请在冰上进行）

成分	使用量	终浓度
2×Quant One Step RT-qPCR Mix（Probe)	25 μl	1×
Hotmaster Taq Polymerase（2.5U/μl)	2μl
Quant RTase （for one step)	0.7 μl
正向引物	-	0.25μM
反向引物	-	0.25μM
探针	-	0.2μM
RNA模板	-
RNase-Free ddH2O	至50μl

  注意：
  ①通常引物终浓度为0.25μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1-1.0 μM范围内调整引物浓度
  ②通常探针终浓度为0.20 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1-0.5 μM范围内调整探针浓度。
  ③建议在反应液中使用10pg～100ng的Total RNA为模板。
2．进行Real Time One Step RT-qPCR反应。
  PCR反应管请用离心机瞬时离心后放入荧光定量PCR仪中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的标准PCR反应程序，如果使用该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。

循环	步骤	温度	时间	内容
1×	1	50℃	30min	反转录
1×	2	92℃	3min	起始模板变性
（可选步骤）* 4×（touchdown)	3	92℃	10sec	变性
	4	45-55℃	30sec	退火
	5	68℃	1min	延伸
35-45×	6	92℃	10sec	PCR循环中模板变性
	7	50-60℃	20sec	退火
	8	68℃	20sec	延伸

3．实验结果分析。
  反应结束后确认Real Time One Step RT-qPCR的扩增曲线，进行RT-qPCR定量时制作标准曲线等。

除了一步法荧光定量RT-PCR试剂盒（探针法),，我公司还供应以下相关产品：
 

货号	名称	规格
BTN130911	miRNA cDNA第一链合成试剂盒	25次
BTN130308	一管式双链cDNA合成试剂盒	10次
WE0145	实时荧光定量PCR的预混体系(探针法)(低含量ROX校正染料)	5ml
ALH190	miRNA荧光定量PCR检测试剂盒	50μl×50次
SY0025	PCR Master Mix (含染料)	1ml
SY0028	2×PCR Plus Master Mix(含染料)	5×1ml
SY0052	腺苷三磷酸溶液(100 mM)(ATP)	1ml
JN0006	一步法RT-PCR试剂盒	200次
JN0020	Phi29 DNA聚合酶	125U
JN0023	热启动Taq DNA聚合酶	250U
JN0044	超敏快速基因组PCR扩增检测试剂盒	20μl×500次
QN0960	通用引物 Random	250μl(10uM)
GL1305	三磷酸腺苷溶液(ATP,10mmol/L)	10ml
QN2077	2×PCR Mastermix(SYBR Green)	50T(1.25ml)|200T(5ml)
WH0083	dNTP混合液（2.5mM)	1ml|5×1ml
WH0210	NGS文库富集试剂	24次|96次