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BaiExact Genotyping qPCR PreMix(Probe)
2年
北京百奥莱博科技有限公司
收到本产品后,请立即置于-20℃
125次|500次
特别提示:包括SNP基因分型PCR试剂(探针法)在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
组分 | 20μl×125次 | 20μl×500次 |
2× BaiExact Genotyping PreMix(Probe) | 1.25ml | 4×1.25ml |
50×ROX Reference Dye | 250 μl | 1ml |
RNase-Free ddH2O | 2×1ml | 5×1ml |
成分 | 使用量(20μl体系) | 终浓度 |
2× BaiExact Genotyping PreMix(Probe) | 10μl | 1× |
正向引物(10μM)① | 0.6μl | 0.1~0.9μM |
反向引物(10μM)① | 0.6μl | 0.1~0.9μM |
探针(10μM)② | 0.4μl | 0.1~0.25μM |
模板 | 2μl | - |
50×ROX Reference Dye③ | - | - |
RNase-Free ddH2O | 至20μl | - |
阶段 | 循环 | 温度 | 时间 | 内容 | 荧光信号采集 |
预变性 | 1× | 95℃ | 2min④ | 预变性 | 否 |
PCR反应 | 40× | 95℃ | 15sec | 变性 | 否 |
60℃ | 30sec⑤ | 退火/延伸 | 是 |
阶段 | 循环 | 温度 | 时间 | 内容 | 荧光信号采集 |
预变性 | 1× | 95℃ | 5min④ | 预变性 | 否 |
PCR反应 | 40× | 95℃ | 15sec | 变性 | 否 |
50-60℃ | 15sec | 退火 | 否 | ||
72℃ | 30sec⑤ | 延伸 | 是 |
原因 | 解决办法 |
目标DNA的拷贝数过少 | 反应液中的目标DNA拷贝数只有几倍到几十倍时,拷贝数散乱的概率变大,容易形成线性混乱。请适当提高样品浓度再进行反应。 |
与引物二聚体发生竞争 | 目的片段扩增的同时出现引物二聚体的扩增,由于竞争使目的片段的扩增反应变弱。请摸索反应条件或重新设计引物,以防止引物二聚体的形成。 |
DNA被反应离心管吸附而损失 | 模板浓度较低或样品稀释后长时间存放时,会导致DNA被反应离心管吸附而损失。请提高样品浓度再进行反应。如果对样品进行稀释,建议稀释后立即进行反应。 |
原因 | 解决办法 |
仪器方面的故障 | 因为仪器的不适用,在温度管理或检测时产生重现性差。请根据相应仪器的说明书进行点检。 |
样品纯度不好 | 不纯的样品会导致实验的重现性差。 |
稀释的模板放置太久 | 浓度较低的DNA溶液存放时间较长时,由于被管壁吸附从而实际浓度会更低,建议从原液重新稀释后再进行反应。另外,通过梯度稀释的标准样品zuì好每次使用时直接从原液稀释。 |
引物或探针质量下降 | 尽量避免新合成引物批次间的差异,可以使用原来质量好的引物做为对照。 |
PCR反应条件、引物浓度、序列等不恰当 | 扩增效率差的PCR较容易产生重现性差。通过变更引物和探针的浓度或PCR反应条件来进行调整。扩增不好时,一般可降低退火温度或提高引物浓度,也可以延长延伸时间。如模板的GC含量较高,可延长变性时间。仍得不到改善时,建议重新设计引物和探针。 |
计量误差 | 反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。 |
原因 | 解决办法 |
发生交叉污染 | 请更换新的试剂或灭菌水。仍无法得到改善时,请尝试到新的实验环境进行操作。 |
仪器设定误差(多重PCR) | 当使用几种荧光探针时,请正确设定荧光测定,防止出现因不同染料的光谱交叉而导致的检测信号差异。 |
原因 | 解决办法 |
检测光光谱设定误差 | 由于目前不同荧光定量PCR仪的原理和提供的检测光光谱范围的差异,因此在选择探针的发光基团和淬灭基团时一定要根据所用的仪器型号设置的可检测的荧光信号范围内选择。请参照仪器的使用说明书,重新确定参数设置。 |
荧光探针纯度太低 | 请使用HPLC级别以上纯化的Probe,否则残留的未结合的荧光染料会造成基线上飘,从而导致扩增产物所产生的荧光值变低。 |
荧光探针质量较差 | 由于探针保存中分解导致基线上飘,从而导致扩增产物所产生的荧光值变低。此外,一部分荧光染料不适合含有EDTA的buffer进行保存。请按照Probe合成公司推荐的保存条件。 |
荧光采集时间太短 | 对部分仪器,需要更长的延伸时间来充分采集荧光。扩增曲线锯齿状较明显时,将延伸时间设定为45-60 sec可得到改善。 |
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