miRNA cDNA第一链合成试剂盒（加A尾法)

特别提示：包括miRNA cDNA第一链合成试剂盒（加A尾法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：miRNA cDNA第一链合成试剂盒（加A尾法)
英文名称：miRNA First-Strand cDNA Kit
产品货号：WH0131
产品规格：20μl×25次|20μl×50次

本试剂盒采用加A法来进行miRNA第一链cDNA的反转录。具体过程是先通过E.coli Poly（A) Polymerase在miRNA 3′末端加多聚A尾Poly（A)，再使用Oligo（dT)-Universal Tag通用逆转录引物进行逆转录反应，zuì终生成miRNA对应的cDNA第一链。

本试剂盒采用了双组分形式，简化了实验操作流程，降低了操作失误的可能性。本产品中的miRNA RT Enzyme Mix包含了E.coli Poly（A)Polymerase、RTase和RNasin。其中的E.coli Poly（A) Polymerase不但具有高效的加A尾效率，还可特异性识别单链miRNA，从而避免了具有双链结构的miRNA前体的进一步逆转录反应；RTase经过分子改造，去掉了RNase H活性，增加了RNA模板亲和力，从而使得miRNA的逆转录反应具有更高的效率和灵敏度。

本试剂盒中的2×miRNA RT Reaction Buffer包含了miRNA加A尾反应和逆转录反应的所有原料和引物，并经过精心优化，可保证miRNA 3′末端的Poly（A)修饰过程和逆转录过程同时高效进行。

本试剂盒须与miRNA荧光定量检测试剂盒（WH0132)配套使用。

产品特点：
·省时省力：本试剂盒将miRAN的加A尾反应和逆转录反应合二为一，在减少操作步骤的同时也节省了一半的反应时间。另外，本试剂盒为双组分形式，操作过程中只需加入RNA模板和两个组分即可进行miRNA的逆转录反应，进一步简化了操作。
·特异性强：本试剂盒中的E.coli Poly（A) Polymerase和RTase都只针对单链的miRNA进行修饰和逆转录反应，因此可zuì大程度的避免具有二级结构的miRNA前体进行逆转录反应。
·灵敏度高：本试剂盒通过将加A尾反应和逆转录反应的整合实现了miRNA的加A产物可全部进行进一步的逆转录反应，大大提高了低丰度miRNA的检出率。
·适用广泛：本试剂盒可针对几乎所有材料提取的miRNA进行逆转录反应，模板的使用范围可达20pg~2μg（质量范围)和10 fM~100 pM （浓度范围)。

试剂盒组成：

组分	20μl×25次	20μl×50次
miRNA RT Enzyme Mix	50μl	100 μl
2×miRNA RT Reaction Buffer	250μl	500 μl
RNase-Free ddH2O	1ml	1ml

储存条件：-20℃下可保存1年。收到本产品后，请立即置于-20℃下保存。从-20℃取出使用时，将miRNA RT EnzymeMix需放在冰中备用；将冻存的2×miRNA RT Reaction Buffer融解，融解后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。

预防RNase污染，应注意以下几方面：
1．经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2．使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3．RNA在裂解液中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4．配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1% （v/v)，放置过夜，高压灭菌)。

操作步骤：
一、反转录体系的配制
解冻2×miRNA RT Reaction Buffer并混匀，miRNA RT Enzyme Mix放于冰中备用，在冰上预冷RNase Free的反应管内加入以下试剂至总体积20 μl （zuì后加入miRNA RT Enzyme Mix)。

组分	使用量	终浓度
Total RNA*	可达2μg	-
2×miRNA RT Reaction Buffer	10 μl	1×
miRNA RT Enzyme Mix	2 μl	-
RNase-Free ddH2O	补至20 μl	-

*反应中所使用的Total RNA必须含有小分子RNA。此过程也可以使用小分子RNA作为模板，建议加入量为2-5 μl。可根据目的miRNA丰度决定加入量，但是对于低丰度miRNA样品而言（如血清血浆提取物)，可直接加入zuì大体积8 μl。

二、反转录程序
移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行miRNA的逆转录反应：

反应温度	反应时间	说明
42℃	60 min	miRNA加A尾反应和逆转录反应
95℃	3 min	酶失活反应

合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存；也可以直接进行下游荧光定量检测。在进行下游荧光定量检测时，为避免逆转录体系对定量PCR反应的抑制，得到zuì适的Ct值（15-30之间)，可将cDNA反应液稀释10-1000倍后使用。

除了miRNA cDNA第一链合成试剂盒（加A尾法),，我公司还供应以下相关产品：
 

货号	名称	规格
ZN0017	ACTA2 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0056	Androgen Receptor/AR mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0166	C/EBPa mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0204	Cathepsin B mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0234	CD14 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0518	Fibronectin/FN mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0645	Hepatic Lipase mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0750	Integrin-α3/ITGA3 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN1066	P21 waf1 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN1123	Pi3-Kinase P85α mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN1153	PLXNB1 mRNA原位杂交试剂盒	100T