诺沃克病毒(GI和GII)双重荧光PCR检测试剂盒

特别提示：包括诺沃克病毒(GI和GII)双重荧光PCR检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：诺沃克病毒(GI和GII)双重荧光PCR检测试剂盒
产品货号：SYA025
产品规格：48次/盒

一、简介：
本试剂盒用一对诺沃克病毒GI型特异性引物，一对诺沃克病毒GII型特异性引物，分别结合一条特异性荧光探针，用一步法双重荧光RT-PCR技术对诺沃克病毒GI型RNA、GII型RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。本试剂盒中诺沃克病毒GI型的探针报告基团为FAM，诺沃克病毒GII型的探针报告基团为HEX/VIC/JOE。

二、用途：
本试剂盒适用于喉咽棉拭子、泄殖腔棉拭子、各种组织样品、尿囊液、细胞培养液、分泌物或粪便及病毒分离培养物等标本中的诺沃克病毒的特异性检测。适用于诺沃克病毒GI型感染的辅助诊断、监测及流行病学调查，其检测结果仅供临床参考。

三、试剂盒组成：(40T/Kit)
组份 数量 规格
诺沃克荧光qRT-PCR反应液(Norovirus GI+GII-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
无核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
阴性对照(NTC) 1管 50μL/管
阳性对照(H5-PTC) 1管 50μL/管

四、储存条件及有效期：
本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为6个月。

五、荧光PCR仪器适用范围：
ABI系列，Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。

六、样品的采集与RNA提取
6.1 样品的采集
按照相关标准采集。标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-80℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。
6.1.1 血清：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22-25℃)放置30-60min，血标本可自发完成凝集析出血清，或直接使用水平离心机，3000rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5mL灭菌离心管。
6.1.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入含EDTA2Na(乙*胺四乙酸二钠)或柠檬酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后即可分离出血浆，转移至1.5mL灭菌离心管。
6.1.3 拭子、分泌物等样品：在装有拭子或分泌物的离心管中加入500μL PBS或生理盐水，剧烈振荡30s。棉拭子尽量挤出液体转移到无RNA酶污染的离心管中，6000rpm离心20s，取上清备用。
6.1.4 病灶组织样品：称取组织约0.1g于研磨器或组织匀浆器中研磨(最好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理盐水研磨至无块状物，然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液于1.5mL灭菌离心管中。
6.2 RNA提取
可按常规方法提取，也可采用商品化试剂盒提取病毒RNA。
6.2.1 取无RNA酶的1.5 mL Eppendorf离心管，做好标识。
6.2.2 加入600 μL 裂解液，200 μL样本，200 μL 氯*，混匀器上振荡5 s，4℃ 12000 rpm离心15 min。
6.2.3 吸取步骤6.2.2中的上清液转移至新的无RNA酶的1.5 mL Eppendorf离心管中(避免吸出中间层)，加入400 μL 异*醇，颠倒混匀。
6.2.4 4℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清；加入600 μL 75％乙醇。
6.2.5 4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清。打开离心管管盖，室温干燥5 min-10 min。
6.2.6 加入10μL 无核酸酶水，溶解管底的RNA，5000 rpm离心5 s，-20℃保存。若长期保存需放置-80℃冰箱。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

七、检测步骤
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qRT-PCR反应液(NorovirusGI+GII-qRT-PCRMIX)、酶混合物(EnzymesMIX)，室温融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合液 1µL N×1µL
总量 15µL N×15µL
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(Norovirus GI+GII-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qRT-PCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
反转录(Reverse Transcription) 1循环 45℃ for 10 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 45 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM和HEX/VIC/JOE。其中FAM基团检测GI，HEX/VIC/JOE基团检测GII。

八、结果分析：
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
8.2 试验成立判定
(1)阴性对照(NTC)：FAM和HEX/VIC/JOE通道全部阴性。
(2)阳性对照(NorovirusGI+GII-PTC)：FAM和HEX/VIC/JOE通道均有扩增。
(3)以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
8.3 结果判定
(1)FAM通道：Ct值≤35 Norovirus GI病毒核酸为阳性；Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明Norovirus GI病毒核酸阴性。Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明Norovirus GI病毒核酸阳性；否则判为样本阴性。
(2)HEX/VIC/JOE通道：Ct值≤35 Norovirus GII病毒核酸为阳性；Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明Norovirus GII病毒核酸阴性。Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明Norovirus GII病毒核酸阳性；否则判为样本阴性。

九、注意事项：
(1)初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
(2)所有使用的离心管最好高压灭菌，而且必须不含RNA酶。
(3)PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
(4)样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
(5)试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。


除了诺沃克病毒(GI和GII)双重荧光PCR检测试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：
 

货号	名称	规格
SYA036	铜绿假单胞菌单重荧光PCR检测试剂盒	48次/盒
SYA055	流感嗜血杆菌/肺炎链球菌双重荧光PCR检测试剂盒	48次/盒
SYA066	弯曲菌单重荧光PCR检测试剂盒	48次/盒
SYA081	肠出血性大肠杆菌(O157:H7)单重荧光PCR检测试剂盒	48次/盒
SYA108	大肠杆菌致贺毒素黏附抹平因子(Eae)/溶血素(Hly)双重荧光PCR检测试剂盒	48次/盒
SYA120	弗朗西斯土拉菌单重荧光PCR检测试剂盒	48次/盒
SYA126	卵形疟原虫单重荧光PCR检测试剂盒	48次/盒
SYA127	立克次体通用单重荧光PCR检测试剂盒	48次/盒
SYA133	贝氏柯克斯体单重荧光PCR检测试剂盒	48次/盒
SYA258	金黄色葡萄球菌单重凝胶PCR检测试剂盒	48次/盒
BTN11-180405	产气荚膜梭菌核酸荧光Lamp检测试剂盒(荧光恒温扩增法)	50次
BTN11-180	副结核杆菌PCR检测试剂盒	50次