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小鼠结肠上皮细胞提取物
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上海康朗生物科技有限公司
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干冰
消化系统
结肠分升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠4部分,大部分固定于腹后壁,结肠的排列酷似英文字母“M”,将小肠包围在内。结肠横切面由内到外依次为:黏膜(上皮层、固有层、黏膜肌层),黏膜下层(疏松结缔组织),肌层(内环形、外纵行两层平滑肌),外膜(纤维膜或浆膜)。肠黏膜上皮细胞是机体内外环境的重要屏障,持续暴露于大量抗原中,也是机体面对病原微生物的第一道防线。因此,肠黏膜上皮细胞除有吸收、分泌和转运等重要生理功能之外,在黏膜先天性和获得性免疫防御机制中也起着重要作用。肠黏膜上皮细胞作为首先接触抗原的细胞,在黏膜免疫反应的起始阶段发挥关键作用,它决定黏膜免疫反应的发生、性质和强度。探讨正常结肠黏膜上皮细胞的分离、体外培养方法,为研究肠黏膜上皮细胞以及与肠黏膜相关疾病建立合适的细胞模型。
基因组DNA制备:采用酶解法裂解细胞,利用硅胶膜离心柱特异地吸附DNA,去除蛋白质、盐类、脂类等杂质,有效地保持基因组DNA的完整性。提取的DNA适用于酶切、PCR、Southern Blot等实验。 总RNA制备:利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol试剂分离RNA,然后用Qiagen RNA Clean Kit进行纯化。康朗生物提供的总RNA样品附有RNA样品OD值、浓度、总含量等。 cDNA制备:纯化后的总RNA来合成cDNA第一链,以50ul总反应体系进行逆转录,体系中包括MMLV反转录酶和随机引物以及2μg总RNA。68℃反应10min 后终止RT反应。利用1x RT Buffer 运输cDNA,1 μl cDNA 足够做一次PCR反应。所有cDNA产品在订单发货之前都经过了严格的质控分析,保证了产品的质量。 microRNA制备:采用具有超强的裂解能力和抽提灵敏度microRNA试剂盒制备,结合试剂盒采用的特殊吸附膜,大大增加了小分子RNA的吸附力,获得的microRNA纯度好,得率高,可以直接用于各种下游实验,如Northern Blot分析,Real-Time PCR,Microarray Analysis等。 蛋白制备:利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl,1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制备细胞蛋白裂解液,离心去除细胞碎片,通过Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度,组织蛋白稀释后用非还原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巯基乙醇及PMSF,-80度保存。 细胞沉淀制备:首先分离培养出高质量的原代细胞,然后经平衡盐溶液清洗去除细胞表面杂质,最后用合适的裂解液裂解细胞并离心获得细胞沉淀。
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