MycoLight比率细菌膜电位试剂盒，红色/绿色荧光

操作方法

1.在任何适当的培养基中培养细菌从对数期培养物中获得健康细菌的结果。在PBS（组分C）或等效的无菌缓冲液中将细菌培养物稀释至~10⁶个细胞/ mL。可以直接从培养基中稀释细菌而不洗涤。准备足够的悬浮液，每次测试提供500 mL。

2.将500μl细菌悬浮液等分到流式细胞仪管中，进行每个染色实验。准备两个额外的管用于去极化控制和未染色的对照。

3.向去极化的对照样品中加入10μl500μMCCCP（组分B）并混合。

4.向每个流式细胞仪管中加入5μlMycoStainIt Green（100X）（组分A）并混合（不要在未染色的对照样品上加入染色剂）。在室温下孵育样品30分钟。可在5分钟后分析染色样品，但信号强度继续增加直至约30分钟。

5.可以在配备有发射488nm的激光的流式细胞仪中测定染色细菌。在绿色（荧光素滤光片）和红色（德克萨斯红色滤光片）通道中收集荧光。应使用对数信号放大收集前向散射，侧向散射和荧光。

6.仪器调整对于检测细菌等相对较小的颗粒尤其重要。使用未染色的对照样品定位前向和侧向散射通道中的细菌群。使用侧向散射作为设置采集触发器的参数。

7.如上所述，在调节流式细胞仪后应用去极化的对照样品。使用正向散射和侧向散射对细菌进行门控并调整荧光光电倍增管电压，使得绿色和红色MFI值近似相等。不要设置补偿。

8.虽然红色和绿色荧光强度的相对量将随着细胞大小和聚集而变化，但红色与绿色荧光强度的比率可以用作膜电位的尺寸无关指示。还可以通过使用正向散射与侧向散射对细菌进行门控来处理数据，并使用红色与绿色荧光的点图分析门控群体，将MFI值报告为线性值，而不是通道。

9.在比率直方图上，在感兴趣的峰周围设置标记并记录平均比值。对于红色与绿色荧光的点图，设置感兴趣群体周围的区域并记录每个的红色和绿色平均荧光强度（MFI）值。为了评估数据，将红色种群MFI除以绿色种群MFI。

10.在流式细胞仪中，细菌仅根据其大小和染色能力进行鉴定。通过荧光显微镜检查每个样品，以确认检测到的颗粒确实是细菌。