敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)

特别提示：包括敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)

产品货号：敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)
产品规格：100T

保存：置4℃。
工作量：100张切片。
有效期：一年。
所谓原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具，其作用是免疫组化所无法代替的。具有敏感性特高，操作简便和结果准确的优点。该试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶检测，一种为碱性磷酸酶检测系统。用于mRNA的杂交。仅适于Digoxin高效标记的寡核苷酸探针，不推荐使用每个探针分子仅标记一个Digoxin的寡核苷酸探针。
如果使用 cDNA 探针，应在杂交之前变性探针。
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2．预杂交液 2ml；
3.寡核苷酸探针杂交稀释液 2ml；
4．封闭液 5ml;
5.生物素化鼠抗Digoxin 5ml;
6．SABC-POD 5ml；
7．生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,0.5M PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：缓冲液的配备
3%柠檬酸——100ml 蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)3g,PH2.0 左右。
2×SSC——1000ml 蒸馏水中加氯化钠 17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O，分子量 294)8.8g。
0.5×SSC——300ml 蒸馏水加 100ml 2×SSC 即可。
0.2×SSC——270ml 蒸馏水加 30ml 2×SSC 即可。
20%甘油——20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可。
0.5 M PBS ——1000ml蒸馏水加氯化钠 30g,Na2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O
0.4g,PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入 0.1%的DEPC 处理，以抑制 RNA酶对 mRNA的分解作用.
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度 10-20μM。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和 5%的CO2，所用培养基为Dulbecco 基础培养基。细胞长好后 0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲*/0.1 M PBS，含有 1/1000 DEPC。室温固 定 20--30分钟。蒸馏水洗，干燥后可-20℃冰冻保存 2 周。
4．30%H2O2 一份+甲* 50 份混合，室温处理 30分钟以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗涤 3次。
5．暴露 mRNA 核酸片段：切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加 2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化 5—120 秒钟。有时也可以不消化。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加 20%甘油 20ml 以保持湿度。按每张切片 20μl加预杂交液。恒温箱 37-40℃2—4 小时。吸取多余液体，不洗。
7．杂交——用杂交稀释液 稀释Digoxin标记的寡核苷酸探针，浓度一般 0.5-2μg/ml。按每张切片加 20μ ι 杂交液。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭掉后，盖在切片上。恒温箱 37—40℃杂交过夜。
8．杂交后洗涤：去掉盖玻片，30—37℃左右水温的2×SSC洗涤 5分钟×2次；0.5×SSC洗涤 15分钟×1次；0.2×SSC洗涤 15分钟×1次。必要时可重复 0.2×SSC洗涤 1次。
9.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
10.滴加生物素化鼠抗Digoxin：37℃60或室温 120分钟。0.5M PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
11.滴加 SABC：37℃20分钟或室温 30分钟。0.5M PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温 30分钟。0.5M PBS洗5分钟×4次。
13.DAB 显色：使用 DAB 显色试剂盒—1ml 蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C 各一滴，混匀，加至标本上。镜下控制显色，一般在 30分钟内。若无背景出现则可继续显色。也可自配 DAB显色剂后显色。充分水洗。
14.必要时苏木素复染，充分水洗。
15.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲*/0.1 MPBS，含有 1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过 4mm的小块，固定 1 小时即可，较大的标本固定不要超过 2 小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间 30-40分钟，一定不要超过 1 小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度 6-8μM。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。3%H2O2 室温处理 10分钟以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗涤 2次。
4．暴露 mRNA 核酸片段：切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加 2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化 3--30分钟(视标本厚薄、新旧自行调整)。充分的消化可以使 mRNA 得到暴露，从而增强杂交信号；但另一方面，过度的消化又使切片明显减薄乃至消失，从而失去杂交信号。由于用户的切片情况各不相同，这就需要用户比较不同的消化时间，例如 10分钟，20分钟，30分钟，以找到最佳的消化时间。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
其余步骤和冰冻切片 6-15 步相同。
结果观察：
阳性细胞的胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。有其它明显的非特异性染色现象时，可以用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释 2—5倍。

除了敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD),，我公司还供应以下相关产品：


BTN131036 5′末端同位素标记试剂盒 20次
BTN90605A TdT加尾法DNA探针标记试剂盒 5次
BTN100920 生物素标记dUTP溶液(Biotin-11-dUTP) 50μL
BTN130904 超级杂交液(Oligo探针) 10mL
BTN120644 聚乙二醇 100g
YT360 氯离子荧光探针(MQAE) 20mg
KFS158 线粒体红色荧光探针 100μL
KFS166 Fluo-2, AM(Ca2+ GPCR分析-钙离子指示探针) 1mg
KFS174 锌离子荧光探针 TSQ (6-甲氧基-(8-p-甲*磺酰胺)喹*(代"啉")(HCS FACS) 1mg
KFS179 异硫*酸荧光素 1g
SY0563 Hoechst 33342 染液(1mg/ml) 1ml
SY0569 溶酶体绿色荧光探针 50μl
SY0582 碘化丙啶(PI)染液(即用型) 150T
SY0601 线粒体超氧化物红色荧光探针 50 μg
SY0602 Alexa Fluor 488-N-羟基琥珀酰亚胺酯 1mg