贝氏柯克斯体单重荧光PCR检测试剂盒

贝氏柯克斯体单重荧光PCR检测试剂盒
本试剂盒适合于检测全血等样本中的贝氏柯克斯体通用，用于贝氏柯克斯体通用感染的辅助诊断，其检测结果仅供参考。

本试剂盒用一对贝氏柯克斯体通用特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对贝氏柯克斯体通用的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

贝氏柯克斯体单重荧光PCR检测试剂盒组成：

组分	数量	规格
贝氏柯克斯体反应液(qPCR MIX)	1管	672μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction)	2管	1.5mL/管
酶混合物(Enzymes MIX)	1管	48μL/管
阴性对照(NTC)	1管	50μL/管
贝氏柯克斯体阳性对照(PTC)	1管	50μL/管

储存条件：-20℃以下，有效期6个月。

贝氏柯克斯体单重荧光PCR检测试剂盒使用方法：

一、样品采集：
用注射器取血5mL至EDTA-2Na抗凝管，取抗凝血下层血细胞50μL，加入100μL双蒸水吹匀。

二、DNA提取：
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
对上述处理好的样本加入等体积核酸提取液(固体标本加入50μL核酸提取液)，100℃恒温处理10min，13000rpm离心5min，取上清液转移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

三、贝氏柯克斯体单重荧光PCR检测试剂盒检测步骤：
1．试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂	每个反应加入的量	N个反应加入的量
荧光PCR反应液	14μL	N×14μL
酶混合物	1 μL	N×1μL
总量	15 μL	N×15μL

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
2．qPCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。推荐循环条件：

1循环

50℃ for 2 min预变性

1循环

95℃ for 10 minPCR扩增

40循环

95℃ for 15 sec 60℃ for 60 sec

在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

四、结果分析：
1．结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2．试验成立判定
?阴性对照：不应产生任何的扩增曲线。 
?阳性对照：均产生扩增曲线。
?以上条件应同时满足 ，否则，此次试验视为无效。
3．结果判定
?在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明贝氏柯克斯体核酸阳性。
?Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明贝氏柯克斯体核酸阴性。
?如果Ct值>35，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
?对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行贝氏柯克斯体 qPCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明贝氏柯克斯体核酸阳性；否则判为样本阴性。

五、注意事项：
?初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
?所有使用的离心管最好高压灭菌，而且必须不含DNA酶。
?PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
?样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
?试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。