小鼠胚胎成纤维细胞

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培养条件
小鼠胚胎成纤维细胞DMEM培养基(添加NaHCO3 1.5g/L)，90%；优质胎牛血清，10%
气相：空气，95%；二氧化碳，5%
温度：37摄氏度
细胞描述
小鼠胚胎成纤维细胞细胞生长：贴壁生长
细胞形态：成纤维细胞样
细胞数量：1×106个
细胞传代：1:3传代；2~3天换液1次
细胞特性：取孕9天的CD1小鼠胚胎，去除脑、心脏等培养建立。该细胞可用作饲养层细胞，支持胚胎干细胞ES的生长并维持ES未分化的状态。当作为饲养层细胞时，MEF需经处理停止生长。建议作为ES细胞的饲养层时，MEF不要超过6代。
细胞纯度：93％
细胞活力：87％（Viability by Trypan Blue Exclusion）
细胞检测：细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌
细胞冻存：液氮冻存（基础培养基+10%DMSO+20%FBS）
细胞运输：干冰运输（1 Vial）或活细胞运输（T-25 flasks）
细胞用途：只可用于科研，不可用于临床诊断和治疗

细胞传代： 
小鼠胚胎成纤维细胞1. 显微镜下观察细胞，神经干细胞悬浮成“神经球”生长，通常情况下，每两天换液一次，每四天传代一次。
2. 在生物安全柜或者超净台中，将培养瓶中的含有神经球的培养基转移到15ml离心管中。
3. 500rpm离心5分钟，收集神经干细胞。
4. 加入1ml 0.125%含有EDTA的胰酶，在超净工作台中轻轻吹打10次，注意不要消化太久，消化的目的是缩小神经球的体积，不要消化能单个神经干细胞，那样会影响其生长速度。
5. 然后加入5ml培养基，吹打均匀后1000rpm 离心5分钟。
6. 离心后，去掉上清，用新鲜培养基重悬细胞，按照1:2-1:3的比例进行细胞传代培养。
细胞复苏： 
1. 小鼠胚胎成纤维细胞 取出冻存管后，投入37℃水浴中，震荡解冻2 min。
2. 酒精消毒管壁外侧后，将其转入超净台中，将管内细胞转移至离心管中，加入5 ml 37℃预热的DMEM/F12+10%FBS培养基。
3. 将离心管离心（1000rpm，5 min）。
4. 弃去上清，再加入2ml DMEM/F12+1%N2+2%B27完全培养基，转入培养瓶中培养。
细胞冻存：液氮冻存（冻存液：DMEM/F12+10%FBS+10%DMSO）。
细胞运输：干冰运输（冻存管）/ 常温运输（T-25培养瓶）
细胞鉴定：神经干细胞采用nestin免疫荧光染色鉴定。左图是白光视野中的“神经球”形态，放大倍数为200x，右图为nestin染色后的荧光图片（绿色），放大倍数为200x。
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小鼠胚胎成纤维细胞悬浮细胞的传代
悬浮细胞传代比贴壁细胞传代稍微简单一些。由于细胞已经在生长培养基中悬浮，因此无需通过酶的作用使其从培养容器表面脱离，整个过程较为迅速，对细胞的损伤也较小。悬浮培养时不进行生长培养基的更换；而是每 2 到 3 天加料一次，直到细胞汇合。可以直接在培养瓶中稀释细胞，然后继续培养扩增，或者也可以从培养瓶中取出一部分细胞，将余下的细胞稀释到该细胞系适宜的接种密度。悬浮细胞传代后的延滞期一般比贴壁细胞短。