植物线粒体DNA提取试剂盒

本试剂盒用于从植物叶片中分离出完整而纯化的线粒体。适合于田间采摘或者实验室培养的植物叶片中线粒体DNA的提取制备。线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心得到比较纯净的线粒体，再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA，最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。

试剂盒组成：

组份	50T	100T	保存温度
DNase I	12mg	22mg	-20℃，溶解后分装
RNase A	0.5ml	1ml	-20℃保存，经常使用可2-8℃放置
β-巯基乙醇	1.0ml	1.0ml*2	常温，通风处保存
植物细胞裂解液	100 mL	200 mL	2-8℃
线粒体清洗液	25 mL	50 mL	2-8℃
DNA酶反应液	6ml	12ml	2-8℃
线粒体裂解液	10ml	20ml	常温放置，如有沉淀可37℃水浴
蛋白沉淀液	7.5ml	15ml	2-8℃
核酸助沉剂	0.5ml	1ml	2-8℃
TE缓冲液	25ml	50ml	2-8℃

保存条件：2～8℃一年，RNase A及DNase I -20℃保存。使用前，在DNase I中加入600μL(50T)或者1100μL(100T)的DNA酶反应液，分装后-20℃保存三个月，如果超过三个月，活性可能会降低，请自行订购DNase I。线粒体裂解液使用前常温保存，如有沉淀可37℃水浴溶解，不影响使用。


操作步骤：
准备工作：在DNASE I中加入600μL(50T)或者1.1mL(100T)的DNA酶反应液，适当分装后-20℃保存。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀37℃水浴溶解，离心机温度下降到4℃(2～8℃)，如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间为10min的改为5min，但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。

1．样本采集前处理：无论田间自然生长还是实验室组织培养，采摘前需避光生长24～48小时，以减少叶片组织中糖类及叶绿体含量。取适量植物细胞裂解液，加入0.5% β-巯基乙醇，10ml植物细胞裂解液加入50μLβ-巯基乙醇，混匀，形成植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液，此溶液可2～8℃保存一个月。
2．叶片用蒸馏水清洗2-3次，滤纸吸干，有条件请用液氮研磨叶片1-2克，研磨完后，取800mg左右研磨的叶片粉，加入1.5ml预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液，混匀。如果无条件(无液氮)，请预冷研钵，取洗过的叶片1000mg，用剪刀剪为碎块放入玻璃匀浆器或者研钵中。加入1.5ml预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液，冰上研磨至看不见明显组织块；
3．将研磨物放置合适的离心管，4℃，1000×g 离心5min；
4．将上清转移到一新的离心管中，在沉淀中加入0.5ml植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液，混匀，再次4℃，1000×g离心5min，取上清；合并两次上清，将上清4℃ 1000×g再次离心5min。
5．取上清，加入一新的离心管中，4℃，16,000×g离心10min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。
6．在线粒体沉淀中加入0.5 mL线粒体清洗液重悬线粒体沉淀，4℃，1000×g离心5min；
7．取上清，加入一新的离心管中，4℃，16,000×g离心10min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；
8．加入100μL DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10μL DNASE I溶液(见准备工作)，混匀，37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃，12,000×g离心5min。尽可能的弃上清，再加入200μL TE重悬线粒体沉淀，4℃，12,000×g离心5min，洗去残留的DNA酶。
9．得到的沉淀，用200μL TE缓冲液重悬线粒体沉淀，加入10μL RNase A。加入200μL线粒体裂解液，轻轻混匀(不可吹打)，放置1～2min，再加入150μL蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃，12,000×g离心5min。此步骤可进一步去除核DNA。
10．取上清，加入一新的离心管中(如用于酶切分析，可加入此步：选用等体积的酚氯fang异wu醇25:24:1抽提一次，再用lv仿抽提一次，或者直接用lv仿抽提两次，一般来说，此步可去掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体DNA的损失，因而用于PCR时可省，并不影响后续实验)，加入0.6倍体积的异bing醇(如无异bing醇，可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA，如离心管太满可分两管)及5～10μL 核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右(此步可省)，4℃，12,000×g离心10min。
11．弃上清，再加入1ml 70%乙醇清洗，4℃，12,000×g离心5min。重复用70%乙醇洗一次。
12．弃上清，再次离心1min吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约5～15min。
13．加入20-30μL TE缓冲液,轻弹管底，37℃水浴5分钟，线粒体DNA溶解。
14．进行DNA电泳检测及-20℃保存，进行下步的实验。

注意事项：
1．以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。
2．进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接在第7步的沉淀中加入上样缓冲液裂解线粒体。
3．β-巯基乙醇有毒，请注意通风及防护。