DAB法显色试剂盒(兔IgG)

特别提示：包括DAB法显色试剂盒(兔IgG)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：DAB法显色试剂盒(兔IgG)
英文名称：Western Blotting Rabbit IgG DAB Chromogenic Reagent Kit
产品货号：QN1161
产品规格：1盒

本试剂盒主要用于western blotting的DAB显色，含有抗兔IgG酶标二抗。

SDS-PAGE电泳后，蛋白质按照分子量大小分离，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性的蛋白。

试剂盒组分：
封闭试剂————————————30g
10倍浓缩抗体稀释液———————50ml
酶标二抗————————————0.5ml，效价1:500～3000
20倍DAB浓缩显色液-———————5mlA+5mlB。

常规电泳转膜后:
1) 清洗转印膜：将膜剥离下后，作好标记，一般在左上角剪一缺口。室温用TBS-T 漂洗3 次每次5min,以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。
2) 按5g 封闭试剂加100ml 双蒸水计，配制膜封闭液，配好的膜封闭液为乳白色悬液，将漂洗过的转印膜，封闭液内，摇床震动，室温封闭30min。用TBS-T ，PH7.6 洗液，室温漂洗3 次每次5min。
3) 将10×抗体稀释液用双蒸水稀释成1×（10ml 10×抗体稀释液加入90ml 双蒸水，混匀，可4℃保存三个月）。此稀释液可作为一抗和二抗的稀释液。
4) 用1×的抗体稀释液稀释抗体。根据用量以及一抗的推荐稀释浓度来稀释一抗。将杂交膜放入杂交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育过夜或37℃摇动孵育2h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步将膜沿电泳方向剪成条，分别作好标记，分开孵育。
5) 用TBS-T ，PH7.6 洗液，室温漂洗3 次每次5min。
6) 用稀释好的抗体稀释液稀释抗体。根据用量，按10ml 抗体稀释液加入10ul HRP 标记二抗的比例，配制二抗工作液。将杂交膜放入杂交袋中，加入二抗工作液，封口， 37℃摇动孵育1h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。
7) 用TBS-T ，PH7.6 洗液，室温漂洗3 次每次10min。
8) 配制DAB 显色：根据用量，取TBS-T 4ml，加入DAB 显色液A、DAB 显色液B 各200ul，混匀，加在膜正面，室温下显色。在目标条带显出后，而且背景未出时，放入水中终止显色。

注意事项：
1. 请根据一抗来源选择试剂盒。
2. western blotting DAB显色法操作简单，但其敏感性与ECL发光发有一定的差距，一般只适用于丰度较高的蛋白。
3. 可以根据显色结果来优化实验反应时间。如背景过深，可延长膜封闭时间，加长最终漂洗次数与时间。如果条带过弱，可延长抗体孵育时间。
4. 如果完全没有条带，请检查前期蛋白处理及实验过程， 如果确认无误，反复两次依旧无结果，请换用ECL发光法显色。
5. TBS-T（0.01M）配制方法：称取NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用800ml 的双蒸水溶解，用盐酸调PH 到7.6，再加入0.5ml Tween－20，用双蒸水加至1000ml，混匀即可。（也可按照自己的配制习惯来配制）

储存条件：-20℃避光，有效期一年。

除了DAB法显色试剂盒(兔IgG),，我公司还供应以下相关产品：



名称：石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒
货号：BTN130888
规格：50次
石蜡包埋组织是很重要的临床材料，研究其正常细胞和疾病相关的细胞，特别是癌细胞中标记蛋白的差异表达水平，对于判断癌化的进展，癌症的类型的判定，以方便于诊断和治疗有重要的意义，然而体外培养的细胞的蛋白差异表达水平并不能够真实反映体内细胞的真实状况，因此从石蜡包埋组织中提取蛋白并且加以研究有很重要的意义，本试剂盒通过特殊的快速脱蜡试剂和蛋白质抽提试剂，在两种不同的温度条件下温育，可以将被铰链的蛋白质释放出来，经过简单的离心步骤，上清中含有的蛋白经过沉淀洗涤和溶解后，可以用于Western Blot 、SDS-PAGE、ELISA、2D电泳或蛋白质芯片分析等，本试剂盒可以使用50次左右。

产品特点：
1. 不含有去污试剂，适用于非染色的标本。
2.可以适用于甲醛浸泡的组织标本。
3. 不需要超速离心，可以同时处理多个标本。

试剂盒组成：

成份	规格
预处理试剂A	100mL
预处理试剂B	5mL
提取试剂	5mL
沉淀试剂	75mL
DTT干粉	80mg
使用手册	1份

储存条件：常温下运输和保存，但DTT和提取试剂需要4℃保存，盛装预处理试剂A的瓶子已经密封，请在使用后，将剩余的预处理试剂A倒入一个有内盖的瓶中，同时盖紧内外盖，以防止挥发。盛装预处理试剂A，B和沉淀试剂的瓶盖要盖紧，同时避免火源。

使用方法：
1. 取两块大约10-15μm厚，100mm2石蜡包埋组织切片到1.5mL的干净离心管中，加入1mL预处理试剂A，高速涡悬震荡30 sec，室温静置5 min，期间偶尔颠倒离心管数次。
2. 加入100μL预处理试剂B，涡悬震荡10sec，再10000rpm(10000g)离心2min，移去上下两层的液体。
3. 用500μL的超纯水清洗脱蜡的组织两次，离心并尽量吸去液体，保留组织块沉淀。
4. 加入100μL提取试剂(用前需要将DTT全部加入到装提取试剂的瓶中，摇晃混匀，未用完的提取试剂需要4℃放置)，盖上盖子，涡悬震荡数秒。
5.在水浴锅中100℃加热20 min，短暂离心一下，再用组织研磨棒将切片组织磨碎。
6.在水浴锅中60℃加热2 hour，期间大约每20 min取出，震荡一次。
7. 4℃，12000rpm(12830 g)离心15 min，小心将上清转移到一个新的1.5mL的干净离心管中。注意：在上清中的蛋白质可以在4℃的环境条件下保存一个星期，如果需要长期保存，请放置在-20℃的环境中，同时避免 反复冻溶，也可以使用我公司生产的非干扰型蛋白浓度测定试剂盒对上清中的蛋白质直接定量。
8. 加入1mL的沉淀试剂，涡悬震荡10 sec，在4℃的环境中保持10 min。
9. 4℃，12000rpm离心15 min，去除上清，保留沉淀。
10. 加入0.5mL的沉淀试剂，涡悬震荡10 sec，在4℃的环境中保持10 min，再4℃，12000rpm离心15 min，去除上清，保留沉淀，在通风橱中将试管倒置在滤纸上，让残余的液体挥发干净。
11. 将固体沉淀溶解于合适的自备的缓冲液中，再4℃，12000rpm离心5 min，收集上清，用于SDS-PAGE，Western blot等实验。注意：此上清中含有DNA，RNA 残留，所以溶液有些发粘，加入少量的micrococcal nuclease，benzonase等消化，有助于减少粘性，但是即使不处理一般不会影响后续实验，用枪头将沉淀捣碎。建议使用含有Thiourea ，Urea，NDSB-201或其它强溶解能力的去污试剂的缓冲液有利于沉淀的完全溶解。

注意事项：
1. 为提高石蜡包埋组织中蛋白质的回收效率，必须尽量减少在切片制作过程中甲醛固定时间，同时在石蜡包埋前彻底脱水，甲醛固定的时间越长，蛋白质的提取回收效率越低。
2. 尽量取用从石蜡包埋组织块中切取的薄片，或没有封闭到载玻片上的没有经过苏*精等染色的切片。
3. 材料越新鲜或甲醛固定时间越短，蛋白质的回收效率越高。
4. 提取试剂中含有含有刺激性的化合物，操作时要戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻，沾染皮肤 眼睛后，立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。
5. 对于甲醛浸泡的组织样本，每次可以取5-10mg的组织样本，用双蒸水洗涤离心收集后后，直接从步骤4开始操作。
6. 提取的蛋白沉淀如果用于ELISA、RIA等免疫实验，可能需要先进行抗原修复程序，但是如果用Western Blot或Dot blot实验，一般情况下没有必要。
7. 本试剂盒只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等，由此产生的后果概不承担责任。