农杆菌EHA101感受态细胞

特别提示：包括农杆菌EHA101感受态细胞在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：农杆菌EHA101感受态细胞
英文名称：E.coli EHA101 Rosetta Competent Cell
产品货号：BTN161205
产品规格：10×100μL

 EHA101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签-利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101(pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因，vir基因是T-DNA 插入植物基因组必需的元件。pEHA101(pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移。pEHA101(pTiBo542DT-DNA)型Ti质粒含有筛选标签：kan，赋予EHA101菌株卡那霉素抗性，适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作。

 本公司生产的EHA101化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，pK7WGF2质粒(壮观霉素抗性)检测转化效率>104cfu/μg DNA。EHA101农杆菌的基因型是：C58(rifR)TipEHA101(pTiBo542 D T-DNA)(kanR)Nopaline。

产品组成：

成分	规格
EHA101 农杆菌感受态细胞	0.1ml×10
pKWGF2(10ng/uL)	10μl
说明书	1份

储存条件：干冰运输，-80℃保存，有效期一年。

自备试剂：质粒DNA、液氮等。

使用方法：

转化前准备
1. 冰水浴和37℃水浴。
2.液氮或干冰/乙醇混合物。
3. 将抗性平板在28℃培养箱中平衡至少15分钟。
转化方法
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
2. 每100μL感受态加1μg(体积不大于10μL)质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
3. 加入700μL无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2～3小时。
4. 6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB 平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天(当平板只含有转化所用双元载体抗生素时，28℃培养48小时即可；平板中同时加入双元载体抗生素，20μg/ml rif时，需28℃培养60小时；如果使用的平板含有50μg/ml rif 则需要28℃培养72-90小时)。

注意事项：
1、加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2、混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3、平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。
4、利福平浓度不应高于25μg/mL，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司EHA101感受态计算转化效率时所用平板只含有50μg/mL kan，若所用平板含有20μg/mL rif 则转化效率降低到1/2。
5、培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。

除了农杆菌EHA101感受态细胞,，我公司还供应以下相关产品：



名称：单细胞裂解液(RNA提取)
货号：BTN130804
规格：1mL
本产品为单细胞RNA提取专用裂解液，本裂解液经多次优化，含有多种去污剂、变性剂和盐，可有效抑制核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏，维持核酸结构的稳定含有常用。纯化所得RNA可用于测序、单细胞PCR等实验。本产品足够使用200次以上。

储存条件：低温运输，4℃保存，有效期两年。

名称：B载体
货号：BTN51104
规格：2μg
本产品是专门用于高效快速克隆平末端DNA片段的专用载体,它是由Sma I酶切ClionG载体后经过纯化得到的即用型线性载体。跟ClionG载体一样，本产品带有自杀基因，Sma I位点位于该基因之中，只有当外源平末端DNA 插入片段插入Sma I位点,连接后的DNA转化的细胞才能生长,所以最后得到的转化子几乎都是含有平末端DNA 插入片段的重组子。

产品特点：
1. 即用性，可以直接用于连接反应，免去繁琐的酶切，电泳检测，纯化，去磷酸化，再纯化等步骤。
2. 具有Clion-G载体的所有优点，包括零背景,适用于所有E.Coli菌株,多拷贝的colEI型复制起始位点。
3.高效率，由于自杀基因的使用有效地减除了载体自身环化对平末端DNA 克隆的影响，自身环化得到的转化子在有选择液存在时只占总转化子的1%-5%。
4. 应用广泛，可用于克隆酶切产生的平末端DNA，Pfu酶扩增的PCR片段，cDNA片段，3´和5´RACE片段，Taq酶扩增的PCR片段(部分为平末端)。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期两年。

自备试剂：
1.外源DNA片段。如果含又DNA片段的反应液中不含其他载体DNA(如酶切反应液，PCR反应液)，可以不需要凝胶回收,灭活酶后即可直接将反应液用于连接反应。PCR引物5´端一般为OH基团，最好在PCR后用T4 激酶磷酸化，否则连接效率极低。
2.感受态宿主菌。DH5α，DH10B或HB101等常用E.coli菌株。
3.连接反应试剂。请购买现成试剂盒。
4. 选择培养基。在倒LB 平板之前随产品赠送的选择液和Amp(如果附赠的选择液含Amp,则不必须额外加Amp)按比例加入到LB 之中,使选择液终浓度为1×，Amp 终浓度为50μg/mL(如果附赠的选择液含Amp,稀释到1X后Amp的终浓度即为50μg/mL),混匀后倒盘。

使用方法：

1.连接反应
a. 取新的经过灭菌处理的0.5mL Eppendorf 管,编号。
b. 将100 ng载体DNA转移到无菌离心管中，加两倍摩尔量的外源DNA片段，折合成重量(ng)=(外源DNA片段bp 数X 100 ng×2)/5330bp(载体DNA 长度)
c. 加蒸馏水至体积为8μl，于45℃保温5分钟，使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。平末端DNA片段的克隆可以省去45℃保温5分钟这一步。
d. 加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl，T4 DNA ligase 0.5μl，混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底，于16℃保温1-24小时。
e. 同时做只有外源DNA片段没有质粒载体的组对照反应。没有必要做只有质粒载体而无外源DNA的对照组，因为自身环化的载体不能生长，能够生长的转化子基本上是两个载体分子相互连接形成的新载体。但在有两倍于外源DNA片段存在的情况下,两个载体分子连接的机率很小。
2. E.coli感受态细胞的转化
a. 各取每组连接反应液2μl按标准方法转化E. coli感受态细胞。
b. 每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上，37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。

MCS位点：