酵母膜蛋白提取试剂盒(2D电泳用)

特别提示：包括酵母膜蛋白提取试剂盒(2D电泳用)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：酵母膜蛋白提取试剂盒(2D电泳用)
英文名称：Yeast membrane protein extraction kit (2D electrophoresis)
产品货号：HR0193
产品规格：50T/100T

跨膜蛋白承担各种生物功能，膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。传统制备膜蛋白样品的方法是使用去污剂和表面活性剂增溶。去污剂处理会使膜蛋白丧失其天然结构，因而妨碍了膜蛋白的功能研究。
酵母膜蛋白提取试剂盒是一种基于化学而非去污剂方法的高产膜蛋白提取试剂盒。酵母膜蛋白提取试剂盒可以从各种酵母样本中提取膜蛋白，可用于纯化蛋白的粗品制备及膜蛋白制备。提取过程简单方便。
本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解酵母总膜组份，包括质膜、核膜和各种细胞器膜。
本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。
本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
本试剂盒提取的蛋白样本不含有盐成分，可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验，请使用我公司其他货号的试剂盒。

储存条件：蛋白酶抑制剂-20℃保存；蛋白提取液溶解液2-8℃保存。
有效期：一年。

※ ※ ※ 使用前请仔细阅读产品说明书 ※ ※ ※
使用限制:本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
产品更新:我公司会更新或升级产品，以优化和增强其使用性能，产品说明书会进行相应的版本更新。使用产品时，请参照试剂盒中随产品附带的印刷版说明书，不能参照网上下载的说明书，可能是不同的版本。
需要最新电子版说明书时可以在收到产品后发邮件索取。
使用安全:使用时需要合适的实验室外套，一次性手套。避免皮肤或粘膜与试剂接触。如果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。

注意事项：
1．螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
2．禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
3．样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
4．最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
5．实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。

产品特点：
1．使用方便。
2．含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
3．紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
4．蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。
该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材:
仪器:
●离心机 ● 振荡器 ● 移液器 ●冰箱 ●冰盒
耗材:
●离心管 ● 吸头
试剂:
● PBS

使用方法：

使用注意事项：
● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
● 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
●蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
●可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

1．提取液制备:
每500μl酵母蛋白提取液B中加入2μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
【注】:
● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
2．取适量酵母培养物，在4℃，2500g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。
3．用冷PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4．每100-200μl体积酵母沉淀物中加入500μl酵母蛋白提取液A，混匀后，在室温或37℃条件下轻轻振荡1-2小时。
5．在4℃，3000g条件下离心5-10分钟，移除上清，收集沉淀。
6．在沉淀物中加入500μl冷的(4℃)酵母蛋白提取液B，混匀。
7．在2-8℃条件下轻轻振荡30-45分钟。
8．将提取液在4℃条件下10000×g离心5分钟，取上清。
9．将上清在37℃水浴10分钟。
10．在37℃ 1000×g离心3分钟。
【注】:
● 无37℃条件离心也可室温离心，缩短离心时间至1-2分钟。
● 也可不离心，延长37℃水浴时间至液体澄清，分层明显即可。
11．此时溶液分为2层，小心移除上层部分，留下管底部下层部分大约30-50μl液体。
【注】:
● 下层为粘稠状液体。
12．用50-100μl膜蛋白溶解液溶解该下层溶液，即得酵母膜蛋白样品。
13．将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
【注】:
● 建议用BCA 法进行蛋白定量。相关产品:HR0329。
●蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
常见问题分析:
●蛋白浓度低？
膜蛋白丰度较低，需要加大细胞上样量。处理部分细胞样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A和B的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。各步骤处理时温度必须按照说明书要求的温度进行。
●用什么方法定量蛋白？
建议用BCA 法。不适合用Bradford 法，因为试剂A中含有干扰Bradford 法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford 法定量。
● 提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

除了酵母膜蛋白提取试剂盒(2D电泳用),，我公司还供应以下相关产品：



名称：过硫酸*(APS)
货号：YT625
规格：10g
本品用于配制PAGE胶等，通常先配制成10%的水溶液，然后再用于配制各种PAGE胶。10%过硫酸*水溶液在室温状况下不太稳定，4℃可以保存3-5天，-20℃可以保存1-2个月。

分子式：(NH4)2S2O8
分子量：228.20
纯度：＞98%

储存条件：室温。

名称：TBS(pH8.0,10×)
货号：WE0313
规格：500ml

名称：免疫组化试剂盒(兔源一抗)
货号：WE0314
规格：3ml
  本试剂盒根据生物素与链霉亲和素具有很强亲和力的原理设计。在兔源的一抗与相应靶抗原结合后，本试剂盒中的生物素化羊抗兔二抗与一抗特异结合；二抗上标记的生物素与标记了过氧化物酶的链霉亲和素结合，形成抗原～特异性一抗～生物素化的二抗～HRP标记的链霉亲和素复合物。HRP可以催化底物显色，从而推断待检抗原的存在及分布。该试剂盒使用的生物素化二抗、SA-HRP，均采用优化的标记和纯化技术，使得其染色有更高灵敏度和更低的背景，适合于检测福尔马林固定石蜡包埋组织切片，以及冰冻切片、细胞爬片、新鲜制备的血涂片等。兔Streptavidin-HRP试剂盒适合与百奥莱博即用型或浓缩型抗体配套使用。

试剂盒组成：

组份	3ml
Solution A(Endogenous Peroxydase Enzymes Blocking Buffer，White Solution)	3ml
Solution B(Normal Goat Serum For Blocking，White Solution)	3ml
Solution C(Goat anti-Rabbit IgG，Biotin，Ready to Use，Yellow Solution)	3ml
Solution D(Streptavidin-HRP，Ready to Use，Red Solution)	3ml
DAB-A(20×)	250μl
DAB-B(1×)	5ml

注意事项：
1、本试剂盒仅适用于一抗为兔源抗体的IHC实验。
2、以每张切片加入1滴(约50μl)计算，3ml可做60张切片，18ml可做360张切片。
3、对于内源性生物素含量比较丰富的组织，使用本试剂盒时最好用内源性生物素阻断剂进行封闭。
4、DAB工作液现配现用，配制好的工作液2～8℃避光1小时内有效。
5、实验过程中避免组织片干燥，因此各步孵育时工作液用量必需充足，保证完全覆盖组织样本，且尽量在湿盒中进行孵育。
6、为获得最佳实验结果，请务必优化实验条件及试剂用量。
7、DAB为可疑致癌物，使用时请采取必要的防护措施。
8、本产品仅用于科研，不能用于人体反应或人体治疗。

操作步骤：

1、常规处理欲检测的石蜡或冰冻组织切片或细胞爬片等样本。

1)组织切片或细胞爬片染色前处理：
a. 石蜡切片
脱蜡水化：60ºC烤片1小时，二*苯脱蜡二次，每次5分钟；再依次浸入梯度乙醇(无水乙醇－无水乙醇－95%－85%－75%乙醇)和蒸馏水中各5分钟水化。
b. 冰冻切片和细胞爬片
切片(或爬片)浸于0.01 M pH7.4 PBS洗涤3次×5分钟。然后用0.1%Triton X-100覆盖组织(或细胞)浸润15分钟，0.01 M pH7.4 PBS洗涤2次×5分钟。
2)石蜡切片的抗原修复：绝大大多数情况下，石蜡组织切片用柠檬酸缓冲液高压修复都是适合的。
修复工作液配制：1 L去离子水中加入10ml柠檬酸缓冲液(IHC抗原修复液, 100×)(WE0318)，混匀即可。
修复过程：修复液加入高压锅内，待修复切片浸于修复液中(必需没过组织)，盖上压力锅盖，加热至均匀喷汽，从喷汽开始计时，1~2分钟后压力锅离开热源，自然冷却至室温，取出切片，蒸馏水淋洗后，再用PBS(0.01 M pH7.4)漂洗2次，每次3分钟。

2、滴加适量Solution A白色溶液，即内源性过氧化物酶封闭液室温孵育10分钟，PBS充分淋洗。
3、滴加适量Solution B白色溶液，即封闭用正常羊血清工作液，室温孵育10分钟，甩干。
4、滴加适量一抗工作液(商品化即用型抗体或适当比例稀释的浓缩抗体)，按实验要求孵育，然后PBS充分淋洗。
5、滴加适量Solution C黄色溶液，即生物素标记羊抗兔二抗工作液，室温孵育10分钟，PBS充分淋洗。
6、滴加适量Solution D红色溶液，即HRP标记的链霉亲和素，室温孵育10分钟，PBS充分淋洗。
7、DAB显色工作液配制：根据需要量，将DAB-A和DAB-B以1：19的体积比混匀后即为DAB显色工作液。也可选择每毫升试剂B中滴加1滴(约50μl)试剂A，混匀即可。
8、显色：加适量的DAB显色工作液于需要显色的组织切片或细胞爬片上即可显色，显色时间一般为1-5分钟。显微镜下观察控制显色时间，当达到最佳显色效果后，自来水冲洗终止显色。显色后的切片经复染、脱水透明，封片后可长期保存。

储存条件：2～8℃