病毒RNA提取试剂盒

  本试剂盒采用可以特异性结合病毒RNA的吸附柱和独特的缓冲液系统，适用于从血清、血浆、尿液、脑脊液等无细胞体液及细胞培养上清液中分离病毒RNA。病毒RNA特异性地结合到硅基质膜上，而污染物则流过该膜。通过两次高效洗涤完全去除蛋白质等杂质，然后用无RNase的水或试剂盒提供的RNase-Free Water洗脱高纯度的病毒RNA。由本试剂盒提取的病毒RNA可直接用于RT-PCR、Real-time RT-PCR和印迹分析等实验。

试剂盒组成：

组份	50次
Buffer GL	15ml
Buffer RW1	40ml
Buffer RW2(浓缩液)	11ml
蛋白酶K	12.5 mg
蛋白酶K 储存液	1.2 5ml
RNase-Free Water	10ml
吸附柱RS及收集管	50套
RNase-Free离心管(1.5ml)	50个

自备试剂：无水乙醇，0.9% NaCl。

实验前准备及重要注意事项：
1、向蛋白酶K 中加入1.25ml 蛋白酶K 储存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
2、预防RNase污染，应注意以下几方面：
1)使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2)玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5M的NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
3)配制溶液应使用无RNase的水。
4)操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
3、血清或血浆避免反复冻融导致蛋白变性或产生沉淀，减少病毒滴度进而影响提取病毒核酸的产量。
4、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。
5、Buffer GL如果产生沉淀，可在56℃加热使其溶解后室温放置。
6、所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

操作步骤：
1、室温下取200μl血清或血浆加到1.5ml离心管(自备)中。
注意：不足200μl可以加入0.9 % NaCl(客户自备)补足。
2、向上步溶液中加入20μl 蛋白酶K ，混匀。
3、加入200μl Buffer GL，涡旋震荡15秒。
注意：不要直接把蛋白酶K 加到Buffer GL中。
4、56℃ 孵育15分钟，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底。
5、加入250μl无水乙醇，涡旋震荡15秒，室温孵育5分钟，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底。
6、将步骤5得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，12000rpm(~～13400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入500μl Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9、向吸附柱中加入500μl无水乙醇，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
10、12000rpm 离心3分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：
1)这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR 等)。
2)推荐步骤：将吸附柱放入一个新的1.5ml离心管(自备)中，打开管盖，56℃烘箱孵育3分钟，使吸附柱的膜彻底干燥。
11、将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50μl RNase-Free Water，室温放置5分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
注意：
1)RNase-Free Water体积不应小于20μl，体积过小影响回收率。
2)如果要提高RNA的产量，可用20-50μl新的RNase-Free Water重复步骤11。
3)如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤11。

储存条件：室温(15～30℃)。