阪崎肠杆菌单重荧光PCR检测试剂盒

特别提示：包括阪崎肠杆菌单重荧光PCR检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：阪崎肠杆菌单重荧光PCR检测试剂盒
英文名称：Fluorescent PCR detection kit for Enterobacter sakazakii
产品规格：48次/盒

本试剂盒适合于增菌培养物、疑似病料及食品中阪崎肠杆菌(ESKZ)的检测。阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是乳制品中近几年新发现的一种致病菌。它是存在自然环境中的一种“条件致病菌”，已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，可导致任何年龄层人群的疾病，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁最大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎。本方法为荧光PCR检测方法，反应在同一管内连续进行，操作简单，并有效防止了污染，能对样品中或预培养液中的阪崎肠杆菌进行快速检测，具有特异性高、敏感性强和操作简便的特点。

试剂盒组成：

组分	规格
荧光PCR反应液(ESKZ-qPCR MIX)	672μL
DNA抽提液(DNA Extraction )	2mL
酶混合物(DNA Polymerase MIX)	48μL
阴性对照(NTC)	50μL
阳性对照(ESKZ -PTC)	50μL

储存条件：-18℃以下，有效期6个月。

使用方法：

一、样品采集：
➤食品样品：样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验(GB/T 4789.40-2008)要求进行。
➤血液样品：用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸*)抗凝管，立即混匀。
➤粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
➤病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
 注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。

二、DNA提取：
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购北京百奥莱博科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
➤液体培养物：取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
➤固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
➤粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
➤其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

三、检测步骤：
1．试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(ESKZ -qPCR MIX)、酶混合物(DNA Polymerase MIX)，室温融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂	每个反应加入的量	N个反应加入的量
荧光PCR反应液	14 µL	N×14µL
酶混合物	1 µL	N×1 µL
总量	15 µL	N×15µL

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(ESKZ -PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
2．qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件：

	1循环	50℃ for 2 min
预变性	1循环	95℃ for 10min
PCR扩增	40循环	95℃ for 15s 60℃ for 60s

在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM

四、结果分析：
1．结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2．试验成立判定
➤阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
➤阳性对照(ESKZ -PTC)：均产生扩增曲线，且Ct值≤35。
➤以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
3．结果判定
➤在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明阪崎肠杆菌核酸阳性。
➤Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明阪崎肠杆菌核酸阴性。
➤如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
➤对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行阪崎肠杆菌real time PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明阪崎肠杆菌核酸阳性；否则判为样本阴性。

五、注意事项：
➤初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
➤所有使用的离心管应高压灭菌，而且必须不含DNA酶。
➤PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
➤样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
➤试剂盒里所有物品应视为污染物对待，按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。