miRNA荧光定量检测试剂盒

特别提示：包括miRNA荧光定量检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：miRNA荧光定量检测试剂盒
英文名称：miRNA qPCR Assay Kit
产品规格：125次

  本试剂盒采用SYBR Green I嵌合荧光染料法的原理来进行miRNA荧光定量PCR检测。试剂盒包括检测所需的2×miRNA qPCR premix和Reverse primer。

  2×miRNA qPCR premix是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，所含的荧光染料SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合，使该产品可用于不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。其中的BaldStar Taq DNA polymerase是经化学修饰的高效热启动酶，配合独特的缓冲体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内对miRNA进行准确定量。

试剂盒组成：

组份	125次
2×miRNA qPCR Mixture(ROX)	2×750μl
Reverse Primer，10μM	60μl
ddH2O	1.5ml

备注：本试剂盒须与miRNA cDNA第一链合成试剂盒(WE0157)配套使用。

自备实验材料：qPCR上游引物(Forward primer)。

Forward Primer设计原则
1、遵循引物设计的最普遍原则。
2、以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础和最简单的设计方法。
3、试剂盒中提供的下游引物的Tm值为63.6℃，设计上游引物的Tm值要尽量保证在63.6℃左右。
4、若按照原则“2”的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基(最好为G或C碱基)；也可以在3’端添加1个或几个A碱基；或者5’端和3’端同时修饰。
5、若按照原则“2”的方式直接设计的引物其Tm值过高，可以在引物的5’或3’端去掉几个碱基。

注意事项：
1、试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、miRNA 第一链cDNA 的加入量不要超过Real time PCR 体积10%。
3、对于特殊的检测体系，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA(稀释10倍或者100倍)。
4、本产品中的2×miRNA qPCR Mixture中含有SYBR Green I和ROX染料，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
5、避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降，本产品长期保存可置于-20℃。如果在短期内需要频繁使用，2×miRNA qPCR Mixture可于2～8℃保存。而Reverse primer仍需置于-20℃保存。

使用方法：
1、室温融化2×miRNA qPCR Mixture和Reverse primer(10μM)。
2、使用时请将2×miRNA qPCR Mixture上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经短暂离心后使用。如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。
3、将试剂置于冰上，并按下表配制反应体系：
 

试剂	体积	终浓度
2×miRNA qPCR Mixture(ROX)	10μl	1×
Forward primer(10μM)	0.4μl	0.2μM
Reverse primer(10μM)	0.4μl	0.2μM
miRNA第一链cDNA	Xμl	—
ddH2O	up to 20μl	—

4、反应程序设置如下：
注意！本产品预变性反应必须在95℃ 10分钟下完成！
 

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	40-45个循环
退火/延伸	60℃	1 min
溶解曲线分析	根据PCR仪要求设定

注意：
1)本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。
2)退火温度请以60-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。