2×ligation solution MasterMix

特别提示：包括2×ligation solution MasterMix在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：2×ligation solution MasterMix
产品货号：RFT108
产品规格：150μl

2×ligation solution MasterMix是含有T4 DNA Ligase，ligation buffer的2×MasterMix，实验时，只需加入片段和载体即可进行连接反应。适用于DNA片段和载体DNA的连接以及DNA片段和Linker或Adaptor DNA的连接。按照10μl连接体系计算，每次使用5μl，可以使用30次。

注意事项
1、2×ligation solution MasterMix由于含有T4 DNA ligase，使用前冰浴中彻底融化，混匀后使用。
2、为了提高转化效率，转化时建议所加入连接产物的量不要超过感受态细胞体积的10%。

使用方法：
一、DNA片段和载体DNA的连接
(1)粘性末端的连接
1．反应体系：

	10μl体系	终浓度
线性载体DNA	xμl	10-50 ng
插入DNA片段	yμl	插入片段：载体=1:1-5:1*
2×ligation solution MasterMix	5μl	1×
ddH2O	up to 10μl

注意：载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1～1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng(0.025pmol)，10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。
2、彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3、反应条件：16℃孵育30分钟。
4、可取5μl连接产物热击转化50μl感受态细胞或取1-2μl连接产物电击转化50μl感受态细胞。
注意：
a.若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯*抽提对连接后的DNA片段进行纯化后进行电击转化。
b.若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。
(2)平末端的连接
1、反应体系：

	10μl体系	终浓度
线性平末端载体DNA*	xμl	10-50 ng
插入DNA片段	yμl	插入片段：载体=1:1-5:1**
2×ligation solution MasterMix	5μl	1×
ddH2O	up to 10μl

注意：
a.平滑末端的载体与 DNA 片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。
b.载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng(0.025pmol)，10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。
2、彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3、反应条件：16℃孵育30分钟。
4、可取5μl连接产物热击转化50μl感受态细胞或取1-2μl连接产物电击转化50μl感受态细胞。
注意：
a.若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯*抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。
b.若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。

二、线性DNA的自身环化
1、反应体系：

	10μl体系	终浓度
线性载体DNA	xμl	10-50 ng
2×ligation solution MasterMix	5μl	1×
ddH2O	up to 10μl

2、彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3、反应条件：16℃孵育30分钟。
4、可取5μl连接产物热击转化50μl感受态细胞或取1-2μl连接产物电击转化50μl感受态细胞。
注意：若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯*抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。

三、接头连接
1、反应体系：

	10μl体系	终浓度
线性DNA	xμl	100-300 ng
磷酸化接头	yμl	0.5-1 μg
2×ligation solution MasterMix	5μl	1×
ddH2O	up to 10μl

2、彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3、反应条件：16℃孵育30分钟。
4、65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase。连接产物可以直接进行限制性内切酶酶切反应。

储存条件：-20℃

除了2×ligation solution MasterMix,，我公司还供应以下相关产品：



名称：单细胞裂解液(RNA提取)
货号：BTN130804
规格：1mL
本产品为单细胞RNA提取专用裂解液，本裂解液经多次优化，含有多种去污剂、变性剂和盐，可有效抑制核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏，维持核酸结构的稳定含有常用。纯化所得RNA可用于测序、单细胞PCR等实验。本产品足够使用200次以上。

储存条件：低温运输，4℃保存，有效期两年。

名称：大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞
货号：BTN90505
规格：0.1mL*10
本产品是大肠杆菌BL21(DE3)菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。使用pUC19质粒检测本产品，转化效率可达107。BL21(DE3)菌株适合表达非毒性蛋白。
该感受态细胞用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3 区的lacUV5启动子，该区域整合于BL21的染色体上。
菌株基因型为：F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期半年。

自备试剂：目的DNA、SOC或LB培养基等。

使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μL，可以根据实际情况分装使用。
以下实验以50μL感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA(根据实际情况加入适量的DNA，通常100μl感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA 所饱和)，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。
3. 42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
4. 每个离心管中加入450μl 无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，150rpm 振荡培养45分钟使菌体复苏。
5. 根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB 固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。

注意事项：
1. 涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA 总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA 总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心(4,000rpm，2分钟)后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。
2. 新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养
3. 涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。