1.连接反应
a. 取新的经过灭菌处理的0.5mL Eppendorf 管,编号。
b. 将100 ng载体DNA转移到无菌离心管中,加两倍摩尔量的外源DNA片段,折合成重量(ng)=(外源DNA片段bp 数X 100 ng×2)/5330bp(载体DNA 长度)
c. 加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5分钟,使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。平末端DNA片段的克隆可以省去45℃保温5分钟这一步。
d. 加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl,T4 DNA ligase 0.5μl,混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温1-24小时。
e. 同时做只有外源DNA片段没有质粒载体的组对照反应。没有必要做只有质粒载体而无外源DNA的对照组,因为自身环化的载体不能生长,能够生长的转化子基本上是两个载体分子相互连接形成的新载体。但在有两倍于外源DNA片段存在的情况下,两个载体分子连接的机率很小。
2. E.coli感受态细胞的转化
a. 各取每组连接反应液2μl按标准方法转化E. coli感受态细胞。
b. 每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。