微量BCA蛋白定量试剂盒

目前世界上常用的蛋白浓度检测方法是：BCA蛋白定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit)和Bradford蛋白定量试剂盒(Bradford Protein Assay Kit)。微量BCA蛋白定量检测法与传统方法相比，更简单、更稳定、更灵敏度，BCA法测定蛋白浓度兼容性亦很，不受大部分样本中其他成分的影响，对于5%以内的SDS、Triton X-100、Tween 20、 Tween 80具有很的兼容性。微量BCA蛋白定量检测法是基于Bicinchoninic Acid研制而成，其检测原理是在碱性环境下蛋白质分子中的肽键结构能与Cu2+离子生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+，BCA可敏感的特异的与Cu+结合，形成稳定的有色化合物，在562nm处有高的吸光度值，颜色的深浅与蛋白质浓度呈正比，可根据吸光度值的大小来测定蛋白质的含量。Micro BCA Protein Assay Kit在10～200μg/ml浓度范围内有较的线性关系， 其小检出量为2.5μg/ml。

自备材料：
酶标仪或分光光度计
96孔板或离心管
恒温箱
 
操作步骤(仅供参考)：
取1ml蛋白标准配制液加入到蛋白标准(BSA)(20mg)中，充分溶解后配制成20mg/ml的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，溶解后的蛋白标准溶液应-20℃保存。
取适量20mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为500μg/ml或所需浓度。如取25μl 20mg/ml蛋白标准，加入975μl稀释液，充分混匀，即配制500μg/ml蛋白标准。特别提示：待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中。一般也可以用0.9%NaCl或PBS作为溶解BSA稀释液。稀释后的500μg/ml蛋白标准也应-20℃长期保存。
根据样品数量，按试剂(A):试剂(B):试剂(C)=26:25:1的比例配制Micro BCA工作液，充分混匀。例如取2.6ml BCA试剂A、2.5ml BCA试剂B和0.1ml BCA试剂C，配制成5.2ml Micro BCA工作液。Micro BCA工作液室温24小时内稳定。
将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔，加稀释液补足至20μl。
加适当体积待测蛋白样本到96孔板的样品孔中。如果标准品稀释液与溶解待测蛋白样本的溶液不同，应在待测蛋白样本孔中加入20μl稀释液；如果标准品稀释液与溶解待测蛋白样本的溶液相同，无需在待测蛋白样本孔中加入20μl稀释液。
各孔加入200μl 配置的Micro BCA工作液, 60℃孵育60min。
测定562nm波长处的吸光度(OD值)，540～595nm之间的波长也可。
各孔OD值减去用未加标准品的孔的OD值调零，作出标准曲线，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
 
注意事项：
蛋白标准(BSA)粉末溶解于蛋白标准配制液后，即获得蛋白标准原液，该原液中含有防腐剂，不影响后续检测，该蛋白标准原液-20℃长期保存。
待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中，否者待测蛋白与蛋白标准中所含非蛋白成分不一致，有可能导致测定不准确。
待测蛋白和蛋白标准加入Micro BCA工作液后，如果发现检测效果不佳，可以60℃放置120min，颜色会随着时间的延长不断加深。显色反应也会随温度升高而加快。如果浓度较低，可以适当延长孵育时间或在较高温度下孵育。
测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化，可能的原因是样品中含有严重干扰BCA法测定蛋白浓度的物质。
建议每次测定时都做标准曲线。因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则如需精确测定宜每次都做标准曲线。
如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色皿的小检测体积。应按比例适当加大BCA工作液的用量使总体积不小于小检测体积，样品和标准品的用量亦相应按比例放大。
为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当加热，但是切勿过热，否则易失效。
BCA法检测中样本中不应含有EGTA，否则影响检测结果。