Triton-SDS细胞裂解液

Triton-SDS细胞裂解液由 Triton X-100、SDS、Tris-HCl等组成，并含有蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。作用原理是利用Triton X-100破坏脂质双分子层，溶解胞质和细胞膜，破坏分子间微弱结合键的大部分蛋白质抗原。其浓度在0.1%～1%时即可满足几乎所有溶解的需求，且可补充等离子浓度的盐及使pH接近中性。所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。不宜用Bradford法测定由Triton-SDS细胞裂解液获得样本的蛋白浓度。
 
操作步骤(仅供参考)：
(一)贴壁培养细胞
取Triton-SDS Lysis Buffer置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
去除培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例加入riton-SDS Lysis Buffer。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4℃裂解，通常裂解液作用于细胞1～3s内，细胞就会被裂解。通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μl。
10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)悬浮培养细胞
取Triton-SDS Lysis Buffer置于室温溶解混匀后加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Triton-SDS Lysis Buffer。通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μl。
10000～12000g， 4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)组织样本
取Triton-SDS Lysis Buffer置于室温溶解混匀后加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
把组织剪切成细小的碎片，越小越。
取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解15～30min。
步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的Triton-SDS Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
 
注意事项：
去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。
如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
如果细胞量较多，必需分装成50～100万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
溶解Triton-SDS Lysis Buffer时，应尽量缩短溶解时间，避免裂解液中的有效成分失效。
裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验。如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。
细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4℃进行。