脱氢抗坏血酸(DHA)检测试剂盒(菲咯啉微板法)

脱氢抗坏血酸(DHA)检测试剂盒(菲咯啉微板法)
产品简介：
维生素C(VitaminC)又称L-抗坏血酸(AsA)，是高等灵长类动物与其他少数生物的必需营养素，在生物体内维生素C是一种抗氧化剂，为酸性己糖衍生物，是稀醇式己糖酸内酯，保护身体免于自由基的威胁，同时也是一种辅酶，其广泛的食物来源为各类新鲜蔬果。

有L-型和D-型两种异构体，只有L-型的才具有生理功能，还原型和氧化型都有生理活性。脱氢抗坏血酸(DHA)检测试剂盒(菲咯啉微板法)检测原理是利用还原剂将脱

氢抗坏血酸还原成还原型抗坏血酸，在酸性条件下维生素C(抗坏血酸)把三价铁离子还原成亚铁离子，后者与菲咯啉形成稳定的红色螯合物，以酶标仪534nm处检测吸光度，在一定浓度范围(样品浓度控制在10~250μg/ml)吸光度与抗坏血酸含量呈线性关系，获得抗坏血酸含量。该试剂盒主要用于植物组织中的维生素C(抗坏血酸)的检测，计算出总抗坏血酸含量，从中减去样品中原有的还原型抗坏血酸含量，即得脱氢抗坏血酸含量，其优点是：1、反应稳定，不易褪色；2、操作简便；3、还原糖及其他常见的还原物质对实验没有干扰，因此专一性；4、灵敏度高。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

自备材料：
1、蒸馏水、无水乙醇
2、研钵或匀浆器
3、离心机、离心管或试管
4、pH试纸或pH计
5、分光光度计、比色杯

操作步骤(仅供参考)：
1、稀释组织匀浆液：按组织匀浆液(5×)：蒸馏水=1：4的比例稀释，获得1×组织匀浆液，
待用。
2、制备AsA提取液：取待测材料如青菜、水果、松针等，清洗擦干，准确称量2.5g，加入研磨器内，再加入少量1×组织匀浆液，研磨碎，留取上清，再次用1×组织匀浆液研磨，后一并倒入50ml离心管，补充1×组织匀浆液至22.5ml，充分混匀，4000g离心5min，留取上清液即为AsA提取液。
3、制备DHA待测液：取4mlAsA提取液，加入2mlDHA还原液，用NaOH溶液调节pH至7~8，室温下静置10min，使脱氢抗坏血酸还原成抗坏血酸，再加入1.6ml组织匀浆液(5×)和0.4ml蒸馏水即为DHA待测液。
4、配制系列抗坏血酸标准：取干净的96孔板，按下表进行操作，依次稀释。
5、DHA加样：按照下表设置空白孔、标准孔、AsA测定孔、DHA测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的抗坏血酸含量过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测能设置2平行孔，求平均值。
6、DHA测定：立即混匀，以空白调零，酶标仪测定534nm处系列标准孔、AsA测定孔、DHA测定孔的吸光度。

计算：以系列标准抗坏血酸(5、10、20、30、40、50μg)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程。以AsA测定孔吸光度代入回归方程求得AsA提取液中AsA含量；以DHA测定孔吸光度代入回归方程求得DHA待测液中总AsA含量；总AsA含量与AsA提取液中AsA含量的差值即为脱氢抗坏血酸(DHA)含量。

注意事项：
1、上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。
2、组织匀浆液(5×)久置或低温保存，容易产生乳白色浑浊；如果白色浑浊不明显，可以直
接使用，不影响效果；如果白色浑浊较多，应弃用。
3、待测样品如不能及时测定，应置于2~8℃保存，3天内稳定。
4、如果样品浓度过高，应用蒸馏水稀释后重测，结果乘以稀释倍数。

附录：标准曲线制作：在室温条件下按说明书操作，用酶标仪540nm对系列标准(0、1、2、4、6、8、10、20、30、40、50μg)进行吸光度的测定，其标准曲线如下(仅供参考)：

注意：由于检测仪器和操作手法等条件的不同，标准曲线会有差异，该值仅供参考，根据测定经验显示Vc标准在0.5μg以下，60μg以上，标准曲线会有偏差。