- ¥110
- 晶抗
- JK2813
- 进口/国产
- 2025年07月11日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保质期：
12个月
- 供应商：
上海晶抗生物工程有限公司
- 保存条件：
-20℃
- 规格：
100ml
多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，如Triton、SDS、NP-40等。Western及IP细胞裂解液是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl、NaCl、低浓度Triton X-100， 低浓度sodium pyrophosphate等组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。
操作步骤(仅供参考)：
(一)贴壁培养细胞
取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
按照6孔板每孔加入100～200μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液作用于细胞1～5s内，细胞就会被裂解。
10000～12000g，离心3～5min(如果用冷冻离心机4℃离心效果更佳)，取上清。
进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)悬浮培养细胞
取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入100～200μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。通常6孔板每孔细胞加入100μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150～200μl，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
10000～12000g，4℃离心3～5min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀等操作。
(三)组织样本
取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
把组织剪切成细小的碎片，越小越。
取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
按照每20mg组织加入100～200μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30～60min。
步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入100～200μl裂解液的比例加入含有PMSF的Western及IP细胞裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
按照每20mg组织加入100～200μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。
10000～12000g，4℃离心10～15min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事项：
去除贴壁细胞的培养液时，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。
如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
如果细胞量较多，必需分装成50～100万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
溶解Cell lysis buffer for Western and IP时，应尽量缩短溶解时间，避免裂解液中的有效成分失效。
细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4℃进行。
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文献和实验Cell Lysis/Western/IPSteven Finkbeiner,Departments of Neurology and Physiology,UCSFcompiled by 6/95 by AJS from AB)Fresh 1X LysisFresh 1X LysisFinal5ml10ml2X Lysis 2.5 ml5mlNaCl0.25M0.25ml of 5M0.5 ml of 5MNa3VO40.1mM25l (μl) of 200 mM5l (μl) of 200
其他方法验证更详细的相互作用信息。 图 11：使用抗体进行 Co-IP 与使用 Strep-Tactin®XT 进行pull-down 融合蛋白沉降 pull-down IP 和 Co-IP 通过固定抗体来捕获诱饵蛋白质及其结合分子，而 pull-down 可使用带亲和标签的目的蛋白进行，在体外验证蛋白间的直接相互作用。Pull-down 是通过磁珠/琼脂糖填料固定带有标记的「诱饵」蛋白，从细胞裂解液、纯化蛋白或表达系统中捕获「猎物」蛋白，然后将复合物蛋白分离后进行凝胶或质谱分析，从而确认互作
或者互作蛋白复合物（红色+黄色）洗脱 Step 5：分析检测—Western Blot 或者质谱 常用“黑话” 以上示例图证明了 EDR1 和 EDR4 有相互作用。如果想要设计好实验，先清楚以下常用“黑话”含义。 阳性对照：证实细胞裂解物中确实存在靶蛋白（IP）或者互作蛋白对（co-IP，比如诱饵蛋白X和靶蛋白 Y），即为常说的 input。可直接取抽好的蛋白溶液进行 Western。 阴性对照：用来排除假阳性。IP/co-IP 后靶蛋白或者互作蛋白对都检测到了，固然是值得高兴
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