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- 2025年07月12日
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BestBio贝博生物
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50T
BB-41035 BestBio贝博生物 Annexin V Alexa Fluor647 / PI 细胞凋亡检测试剂盒
细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定和一些疾病发生过程等方面起着十分重要的作用。 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的PS 从而将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程中并不伴随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。 AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。PS 外翻发生在细胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得Annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。
样品染色：
1. 离心收集悬浮细胞。离心机300-500g力，2-8°C，离心时间5分钟，弃培养基。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次。（300g-400g，2-8°C，离心时间5分钟收集细胞）。
3. 用100ul 1X Annexin V结合液悬浮细胞，浓度大约为1-5 X 106 cells/ml。
4. 在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-AF 647染色液，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育5-10分钟。
5. 加入5-10ul PI染色液后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育1-3分钟。
6. 加入400ul PBS或1X Annexin V结合液，轻轻混匀。
7. 立即用流式细胞仪检测。
流式细胞仪分析：
经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。
按照常规的流式凋亡检测的操作即可。
Annexin V-AF 647的荧光最大激发波长652nm，最大发射波长670nm；PI荧光最大激发波长535nm，最大发射波长在620nm。
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文献和实验流式细胞仪分析：
经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。
按照常规的流式凋亡检测的操作即可。
Annexin V-AF 647的荧光最大激发波长652nm，最大发射波长670nm；PI荧光最大激发波长535nm，最大发射波长在620nm。
上机检测前，须用待测细胞制备质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：
（I） 未转染GFP等标记的细胞
① 空白管：阴性对照组细胞，没有染色的细胞。不加Annexin V/AF 647，PI。用于调节电压。
② 单染管：有明显凋亡的细胞，只加Annexin V/AF 647染色。用于调节补偿。
③ 单染管：有明显凋亡的细胞，只加PI染色。用于调节补偿
④ 检测管：待测的处理细胞，加Annexin V/AF 647，PI。用空白管和单阳管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
（II） 转染GFP细胞
① 未转染空白管：未转染细胞，阴性对照组细胞，没有染色的细胞。不加Annexin V/AF 647，PI。用于调节电压。
② 转染GFP空白管：转染GFP的对照组细胞，没有染色的细胞。不加Annexin V/AF 647，PI。用于调补偿
③ 未转染单染管：未转染且有明显凋亡的细胞，只加Annexin V/AF 647染色。用于调节补偿。
④ 未转染单染管：未转染且有明显凋亡的细胞，只加PI染色。用于调节补偿
⑤ 检测管：待测的处理细胞，加Annexin V/AF 647，PI。用空白管和单阳管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
Q：Annexin V 凋亡检测试剂盒的原理是什么？ A：Annexin V 是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸 PS 有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的 PS 与凋亡早期细胞胞膜结合，将 Annexin V 标记荧光染料如 FITC 利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡。 碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)或 7-AAD 可与双链 DNA 特异性结合，并产生强烈的荧光，正常情况下无法透过细胞膜。由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，核染料 PI 或 7-AAD
示例： Jurkat细胞用1μM喜树碱(Camptothecin) (左)或未加药 (右)处理4h，FITC-Annexin V/PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒染色后，流式细胞仪荧光检测。 Annexin V-FITC单阳性细胞为早期凋亡细胞，Annexin V-FITC和PI染色双阳性的细胞为坏死细胞或者晚期凋亡。PI单染色阳性位裸核细胞。 实测数据可能会因细胞类型、细胞凋亡情况，检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。 流式检测细胞凋亡的数据分析方法： 1） 选中所有颗粒，将FSC
Annexin V-PI 双染法 在细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，因而检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是相对分子质量为35 000大小的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(P1)来区分凋亡和坏死细胞。PI
