D-荧光素钠盐 CAS 103404-75-7

D-荧光素钠盐 CAS 103404-75-7
D-荧光素是最流行和多功能的生物发光底物。萤火虫荧光素酶/荧光素生物发光系统存在于萤火虫（Photinus pyralis）和其他几种甲虫中。荧光素酶通过二氧杂环丁酮中间体氧化ATP活化的荧光素。萤火虫荧光素酶通过荧光素的ATP依赖性氧化产生光。来自该反应的560nm化学发光在数秒内达到峰值，当荧光素和ATP过量存在时，光输出与荧光素酶活性成比例。萤火虫荧光素酶长期以来与抗体结合，并在荧光素作为检测底物的免疫测定中用作标记物。与HRP和碱性磷酸酶相比，荧光素酶对化学修饰的耐受性较差。该酶的一个特别优点是除了其高灵敏度之外，在哺乳动物组织中存在低内源荧光素酶活性。荧光素酶的另一个重要用途是卫生监测领域。荧光素酶/荧光素系统可用于检测污染，因为存在于所有生物体中的ATP需要产生发光。这种ATP生物发光的主要应用是通过测试食品加工厂中的表面来确定质量，以确定是否存在设备或产品的污染。

操作方法

以下方案是钾盐和钠盐制备的一个例子，它可以适用于大多数细胞类型和体内动物用途。

1.用于体外生物发光图像测定的实施方案

1.1在无菌水中制备100mM（100-200X）荧光素原液。混合均匀。立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

1.2在预热的组织培养基中制备0.5-1mM D-荧光素的工作溶液。

1.3从培养细胞中分离培养基。

1.4将荧光素工作溶液加入细胞中，并在成像前将细胞在37°C孵育5-10分钟。

2.用于体内生物发光图像测定的实施方案

2.1在DPBS中制备15mg / mL荧光素储备溶液，不含Mg²⁺和Ca²⁺。 混合均匀。

2.2过滤器通过0.2μm过滤器过滤灭菌溶液。立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

2.3在动物体重150mg / kg（或10μL/ g荧光素储备溶液）成像前10-15分钟腹膜内（i.p.）注射荧光素。

注意：应对每种动物模型进行荧光素的动力学研究，以确定峰值信号时间。

3.荧光素报告分析分子测定的实施方案

3.1在无菌水中制备100mM荧光素储备溶液。 立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

3.2制备1mM D-荧光素的工作溶液，其中含有3mM ATP，1mM DTT和15mM MgSO 4的25mM tricine缓冲液，pH7.8。

3.3将5-10μl细胞裂解液移入微孔板中。使用不含裂解液的裂解试剂或缓冲液作为空白。

3.4根据制造商的说明，使用荧光素工作溶液的普利光度计。

3.5注入200μl荧光素工作溶液，无延迟，10秒积分时间。

注意1：D-荧光素钾盐溶于无菌水和缓冲液，溶解度可高达25mg/mL。一般使用浓度为3-15 mg/mL。溶液的pH值、溶液中的氧气和保存时间对其保存过程中的稳定性非常重要。当溶液的pH<6.5（发生水解作用）或>7.5（发生消旋化作用，D型转化为L型）的情况下，D-荧光素钾盐相对不稳定。如果溶液中存在少量的氧气，将加速D-荧光素钾的降解速度。储备溶液可以在不含ATP的水中制备，并在-20°C下避光储存。必须用适当的碱中和游离酸溶解。

注意2：D-荧光素可与任何现有的文献或ATP分析系统一起使用。

注意3：如果检测ATP，请戴上手套并使用无ATP容器，尽量减少所有可能的ATP污染源。仅使用无菌无ATP水和试剂。使用高压灭菌水进行所有试剂制备。

参考文献

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D-荧光素适合做哪些实验?

D-荧光素钾盐和5-氟-荧光素，作为Luciferase的作用底物，常用于以下实验：

1. 报告基因分析
2. In vivo imaging (动物活体成像)
3. In vitro imaging (细胞体外分析)
4. ATP测定
5. 其它luciferase及其基因相关的分析和研究工作

2、D-荧光素应用于活体成像的基本原理

细胞中D-荧光素酶参与的化学发光反应遵守酶促反应的基本原理，在底物D-荧光素钾过量的情况下，反应产生的光子数（发光量）与细胞中的D-荧光素酶的量成正相关，从而可以推算出细胞的数量。

3、D-荧光素钾盐溶液的稳定性

D-荧光素钾盐易溶于水和缓冲液，溶解度可高达25mg/mL。一般使用浓度为3-15 mg/mL。

溶液的pH值、溶液中的氧气和保存时间对其保存过程中的稳定性非常重要。当溶液的pH<6.5（发生水解作用）或>7.5（发生消旋化作用，D型转化为L型）的情况下，D-荧光素钾盐相对不稳定。如果溶液中存在少量的氧气，将加速D-荧光素钾的降解速度。

D-荧光素配成溶液后，在最佳的保存条件（-80°C，最佳pH，无氧气）下，存在固定的降解速度：0.2%/天，因此配成溶液保存的D-荧光素应尽量在1年内使用完。

有水存在的情况下，主要发生消旋化作用，即D-荧光素转化成L-荧光素，有报道称L-荧光素对荧光素酶催化的酶促反应有抑制作用。

4、D-荧光素、D-荧光素钠和D-荧光素钾之间的区别

主要区别在于溶解和分散性能。D-荧光素钾盐在水和缓冲液中的溶解度高，且溶解速度较快，故在一般的生物学试验中常用D-荧光素钾盐。

5、D-荧光素钾盐的保存和运输条件

保存条件：≤-20°C，避光，保持干燥。（在不打开包装的条件下，可保存两年时间）。

运输条件：高纯度的D-荧光素钾盐可在短时间内常温条件下保存，运输条件为常温。

原装（没有打开包装）荧光素的包装瓶中充有氩气，保证其稳定性，打开包装后，请严格按照保存条件保存。

D-荧光素钾盐具有易溶于水的特性，其暴露于空气中，易吸潮。在称量过程中，请考虑其易吸潮的特性，先进行温度平衡，再快速称取。