外显子组测序

一、服务介绍：
 外显子组测序（exome-seq）是对定向富集的基因组DNA进行高通量测序，它能够以相对低的费用对人类外显子组进行拷问。2009年，外显子组捕获工具的出现，让外显子组测序这种技术迅速红起来。到目前为止，已有超过1万个外显子组被测序。
如今有多家公司推出了外显子组捕获试剂，包括罗氏NimbleGen、安捷伦、Illumina，还有最近的华大基因。这些方法究竟孰优 孰劣，斯坦福大学医学院遗传学系的研究人员对市场上三个主流的外显子组测序平台进行了比较。该研究结果发表在《Nature Biotechnology》上。研究人员利用安捷伦、Illumina和NimbleGen的外显子组测序平台对同一个人类血液样品进行分析。他们的结 果表明，NimbleGen平台作为一个使用高密度重叠探针的平台，尽管覆盖了较少的基因组区域，但在灵敏检测小的变异时所需的测序量也最少。在同样 获得80M测序数据的情况下，NimbleGen有97%的目标序列达到10x以上的测序深度，而其他产品只有90%。而安捷伦和Illumina的探针 能够在低密度下捕获更多数量的变异。此外，Illumina还捕获了未翻译的区域，这是NimbleGen和安捷伦平台无法靶定的。研究人员还比较了同一 样品的外显子组测序和全基因组测序（WGS），显示外显子组测序能够检测到WGS错过的小变异。
除了文中提到了三个主流平台，外显子组捕获方面的新产品也在不断推出，研究人员的选择也将更广泛。罗氏NimbleGen即将推出新一代 的外显子液相捕获产品。这一新产品将可捕获64M的基因组序列，包括所有外显子以及miRNA，它含与其他NimbleGen液相捕获产品相同的2.1M 高密度探针，以确保高效、均一、特异、全面的定向捕获。
为了让研究人员更轻松更经济地利用定向外显子组测序，Illumina提供了TruSeq Exome EnrichmentKit，一种溶液型的序列捕获方法，利用杂交选择分离出人类基因组中的目的外显子区域。TruSeq Exome Enrichment Kit提供了迄今为止最为全面的外显子组覆盖度。
二、操作流程 
1、外显子捕获
采用以上三种捕获产品中的任何一种或者多种进行捕获实验。
2、高通量测序样品制备
    样品扩增：Bridge PCR（Illumina平台）
3、上机测序
Illumina系统应用了末端可逆终止测序原理，采用特殊设计的荧光标记的dNTP。 这些核苷酸3'羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。反应结束
后激光扫描反应板表面，读取测序信号。之后，将这些基团化学切割， 恢复3'端-OH，继
续聚合第二个核苷酸，如此循环下去。
4、生物信息学分析
外显子测序后获得原始数据（raw reads），经过过滤去污染、比对参考基因组，获得比对到基因组上的Unique mapped reads。对数据进行标准的信息分析流程，包括对SNP、InDel等进行检测、注释和统计分析。同时对数据进行质控检测，包括测序深度、覆盖度均一性 等分析。
三、生物信息学标准化分析
数据产出的统计
外显子区域测序深度的直方分布图
外显子捕获的均一性分析
一致性序列的获得和SNPs的检测SNPs的注释
插入和缺失（Indels）的检测
插入和缺失（Indels）的注释
四、样本要求
无降解且无RNA污染的DNA样品
单次测序样品量≥3μg，浓度≥50ng/μl
样品纯度OD260/280= 1.8～2.0
五、质量承诺
提供可靠数据和分析结果。

 


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