北京His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)大量库存促销

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北京百奥莱博专业生产销*(代"售")北京His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)大量库存促销，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：北京His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)大量库存促销
编号：WE0267
规格：5ml
英文名：His-Tagged Protein Purification Kit(Soluble Protein)
品牌：百奥莱博
产地：北京
  本试剂盒包含Ni-Agarose填料、亲和柱空柱以及可溶性His融合蛋白纯化所需的全部试剂(细菌裂解液、蛋白酶抑制剂混合物、结合缓冲液和洗脱缓冲液组分)，使用方便。该镍柱纯化系统对6×His-tag蛋白具有显著特异吸附能力，能够高效一步纯化带有6个组*酸亲和标签的蛋白。该系统具有4个Ni2+螯合位点，较只有3个螯合位点的Ni-IDA结合Ni2+更为牢固，有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。较高的基团密度，大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统(如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌)中的His标签蛋白，均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子，可直接用可溶性蛋白的纯化，使用方便，快捷。

镍柱参数：
支持物：CL-6B琼脂糖凝胶
载量：20-30 mg His标签蛋白/ml填料
粒径：50-160μM

试剂盒组成：

 

组份	5ml
Ni-Agarose Resin	5ml
Bacterial Protein Extraction Reagent	65ml
1 M Tris-HCl(pH7.9)	15ml
1 M Imidazole	65ml
3 M NaCl	120ml
Protease Inhibitor Cocktail	700μl
吸附柱(12ml)	一套

保存条件：Protease Inhibitor Cocktail，-20℃；Ni-Agarose Resin，2～8℃，避免冷冻；其它组分，2～8℃

注意事项：
1、在纯化之前采用电泳检测蛋白的可溶性，本试剂盒只适合于可溶性蛋白的纯化，如需纯化包涵体蛋白，请选择我公司的包涵体蛋白纯化试剂盒，货号为WE0266。
2、缓冲液中不建议使用 β-巯基乙醇、DTT和EDTA。
3、整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
4、为提高纯化效率，首先确定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的最佳使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的咪唑浓度，Binding Buffer的范围为0-10 mM，洗脱缓冲液的范围为10-500 mM来进行。并通过SDS-PAGE或Western Blotting来检测目的蛋白的纯度。
5、请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.22μM或者0.45μM过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用0.22μM或者0.45μM过滤器过滤。
6、柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。

使用方法：

I 缓冲液的准备
可溶性蛋白纯化缓冲液配方：


 

组份	Tris-HCl(pH7.9)	Imidazole	NaCl
Soluble Binding Buffer	20 mM	10 mM	0.5 M
Soluble Elution Buffer	20 mM	500 mM	0.5 M

II 组装层析柱
1、将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。
注意：
1)填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每ml填料纯化20-30mg His标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。
2)如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。
3)本实验都是通过重力作用使溶液流出。
2、向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。
注意：柱体积指的是填料的体积。

III 可溶性蛋白的纯化
1、收集菌体后，每100 mg菌体(湿重)加入1-5ml细菌裂解液(每1ml 细菌抽提试剂中已加入10μl 蛋白酶抑制剂混合物)，超声裂解菌体。
注意：
1)当提取物粘度高或提取蛋白为包涵体时，建议加入DNase I和Lysozyme。每1ml 细菌抽提试剂中加入1μl DNase I(1000U/ml)，2μl Lysozyme(50 mg/ml)，DNase I和Lysozyme可单独从我公司购买，货号：Lysozyme(#WE0214)、 DNase I(#WE0213A)，如使用其它公司产品，请按照相应说明书操作。
2)超声过程中保持菌液处于冰浴中，超声条件依赖于所使用的超声仪功率，探头种类，容器的大小形状，需实验中自己摸索，应避免连续超声导致的大量产热，可分成短时间，多次超声，通过一定的间隔时间避免溶液过热。最终菌液变清即可。
2、10000 rpm,4℃离心3分钟，收集上清中的可溶性蛋白。
3、用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。
注意：
1)本试剂盒中附带有一块筛板，使用时先将筛板加至填料的上层，该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤，防止过多的杂蛋白堵塞柱子的作用。再将处理好的样品负载上柱，但是筛板放入柱子后就不易取出。
2)通过控制加入的菌体裂解液的速度来控制流速。
4、使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。
5、使用适量Soluble Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
注意：洗脱峰可以分管收集，每1ml收集1管，并采用蛋白监测仪监测，收集洗脱峰。
6、洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，封柱后2～8℃保存。
注意：如果是分段梯度洗脱，最大洗脱缓冲液中咪唑浓度未达到500 mM时，则使用浓度为500 mM的咪唑进行洗脱10倍柱体积后，再进行第6步的操作。

Ⅳ 柱再生
当填料使用多次后，结合效率会有所下降(表现为流速变慢或填料失去蓝绿色)，可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。
1、使用2倍柱体积的6 M盐*(代"酸")胍冲洗后，使用3倍柱体积的去离子水冲洗。
2、使用1倍柱体积的2% SDS冲洗。
3、依次使用1倍柱体积的25%、50%、75%和5倍柱体积的100%乙醇冲洗，再依次使用1倍柱体积的75%、50%和25%的乙醇冲洗。
4、使用1倍柱体积的去离子水冲洗。
5、使用5倍柱体积含50 mM EDTA缓冲液(PH8.0)冲洗。
6、使用3倍柱体积去离子水，3倍柱体积20%乙醇冲洗。
7、2～8℃保存。
8、再次使用前，需首先使用10倍柱体积去离子水冲洗，然后使用5个柱体积的50 mM NiSO4再生，3个柱体积的Binding Buffer平衡。

储存条件：-20℃

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·溶菌酶
编号：WE0214
英文名称：Lysozyme
规格：100mg

·显影粉
编号：WE0303
英文名称：Developing Powder
规格：20套

·TOP10感受态细胞
编号：WE0251
英文名称：TOP10 Competent Cell
规格：100μl×10支
  本产品是大肠杆菌TOP10菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。TOP10是一种常用于质粒克隆的菌株，其φ80lacZΔM15基因产物可与载体编码的β-半乳糖苷酶*基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。使用pUC19质粒检测，转化效率可达108，适用于高效的质粒DNA克隆并能保证高拷贝质粒的稳定复制。

产品组成：

组份	0.1ml×10支
TOP10 Competent Cell	10×100μl
Control DNA pUC19，0.1ng/μl	10μl

实验前准备及重要注意事项
1、感受态细胞一定要用干冰运输。感受态细胞应在-80℃下保存，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。
2、转化所有步骤均在无菌条件下操作。
3、包装中有0.1ng/μl的pUC19DNA，供对照试验使用。

使用方法：
1、取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。以下实验以50μl感受态细胞为例。
2、待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA(根据实际情况加入适量的DNA，通常100μl感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和)，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。
3、42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
4、向每个离心管中加入450μl无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟使菌体复苏。
5、根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。
注意：
1)涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心(4000rpm，2分钟)后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。
2)新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。
3)涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

储存条件：-80℃。


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·6×UltraStain上样缓冲液
编号：WE0211
英文名称：6×UltraStain Loading Buffer
规格：500μl|500μl×5
  本产品在常规6×Loading Buffer中添加了UltraStain染料，该染料是一种生物大分子，不能穿透细胞膜进入细胞内。相对于EB的强诱变性，是一种安全无毒的核酸染料。使用6×UltraStain Loading Buffer替代原始Loading Buffer时，在制胶过程中无需加入EB等核酸染料，只需要将DNA与6×UltraStain Loading Buffer混匀即可进行凝胶电泳。由于UltraStain与EB具有相同的光谱特性，无需改变滤光片及观察装置，在正常紫外光激发检测即可，使用非常方便和灵活。

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、由于该染料只需在电泳前与DNA混匀，无需加入凝胶中，可使制备的凝胶保存时间更长。
2、由于Loading Buffer中染料的量远高于将染料加入凝胶中的量，对DNA的灵敏度更高。

操作步骤：
1、配置合适浓度的琼脂糖凝胶
2、吸取5μl DNA样品与1μl 6×UltraStain Loading Buffer混匀后，直接电泳于上样孔内，进行常规电泳和图像采集。


图为向Super DNA Ladder(货号：WE0243)中添加1μl 本产品，在不加染料的TAE缓冲液配置的琼脂糖凝胶中的电泳图

储存条件：2～8℃避光

·Western中分子量蛋白Marker
编号：WE0292
英文名称：Western MidiWT Protein Marker
规格：20次(100μl)
  本品是专门为Western Blot实验设计的分子量标准。由4种不同分子量的蛋白组成(20 kD、35 kD、60 kD、110 kD)，这四种蛋白都可与人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、兔的IgG恒定区结合，因此该Marker能与待检抗原在同一张胶片上曝光，阳性信号的分子量大小可以直接通过MidiWT的位置做出准确判断，无需后续图片拼接即可确定目的蛋白。另外该Marker还可以作为Western Blot实验的阳性对照。本产品不经过任何化学修饰，分子量精确，可以准确衡量目的蛋白的分子量大小，推荐上样量为5-10 µl。

注意事项：
1、本产品可直接使用，不需要加热。
2、将产品取出后于室温放置融化，务必使其完全融化，否则影响实验结果。
3、该产品与抗血清或高浓度多克隆抗体一起孵育时可能会出现非特异性条带，此时可降低该Western Blot Marker的上样量至2-5μl。
4、使用新配制的凝胶，及时更换电泳缓冲液和转膜液，以免影响实验结果。

操作步骤：
1、将产品取出后于室温放置融化。
2、温和地充分混匀，取5μl至上样孔中，进行SDS-PAGE电泳。
3、电泳完毕后将凝胶上蛋白转至NC或PVDF膜，依次孵育一抗、二抗。
4、孵育完毕并经充分洗涤后，将印迹膜与ECL工作液反应数分钟，使用X-光胶片曝光或化学发光成像。

实验图例

12%的聚丙*(代"烯")酰胺凝胶电泳后转膜，化学发光法曝光结果。

储存条件：-20℃保存，避免反复冻融


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SY0174 HNF4-GFP报告基因质粒 HNF4 GFP Reporter Plasmid
YT259 STAT5凝胶迁移探针(10μM) STAT5 Probe For EMSA(10μM)
BTN121112 大肠杆菌Stbl3化学感受态细胞 E.coli Stbl3 Chemical Competent Cell
ALH167 真菌基因组DNA提取试剂盒 Rapid extraction kit for fungal genomic DNA
YT478 N端YFP标签融合蛋白质粒(黄色荧光蛋白) N-YFP plasmid（with CMV promoter）
WE0247 TA快速连接试剂盒(pUC-T Simple)(含载体，连接酶) pUC-T Simple TA Cloning Kit
BTN60306 柱式血液DNA提取试剂盒 Blood DNA column extraction kit
SV1151 EcoRI 甲基转移酶 EcoRI methyl transferase
RFT067 40％丙稀酰胺溶液(19:1) 40％ Acylamide Solution(19:1)
KFS193 Annexin V-kFluor555/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-kFlour555 Apoptosis Detection Kit
SY0431 Anti-DYKDDDDK Flag亲和纯化凝胶 Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel
SV0296 CviKI-1限制性内切酶 CviKI-1 Restriction Endonuclease
BTN100881 电泳级SDS溶液(10%) SDS Solution，EG

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