北京现货一步法快速WB试剂盒(兔源一抗)(国产,进口)

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北京现货一步法快速WB试剂盒(兔源一抗)(国产,进口)由专业试剂供应商北京百奥莱博提供，用于生化研究，本产品质量好，且极具价格优势，深为用户称道，了解更多一步法快速WB试剂盒(兔源一抗)等蛋白质研究产品请联*(代"系")我司咨询订购。

名称：北京现货一步法快速WB试剂盒(兔源一抗)(国产,进口)
编号：WE0298
规格：50次
英文名：One Step Western Kit HRP(Rabbit)
品牌：百奥莱博
产地：北京
  本试剂盒是百奥莱博最新研发的Western Blot检测试剂盒，能够在1小时左右得到高质量的Western Blot结果，且操作简便、检测灵敏度高、背景低、不需再加入二抗、系统稳定性强。常规的Western Blot间接法检测过程(封闭、一抗结合和二抗结合)需要较长的时间，实验流程复杂且需要多步条件优化。胶上的蛋白转移到载体膜上后，使用试剂盒中的封闭液孵育5 min，再用抗体反应液处理后的一抗孵育载体膜，经洗涤三次(每次5 min)后，即可进行发光或显色检测。本试剂盒针对目的蛋白一抗为兔来源的实验系统使用。

组份	50次
Blocking Buffer	500ml
Antibody Pretreat Solution(HRP/Rabbit)	5×1ml
Dilution Buffer	500ml
Wash Buffer(10×)	500ml

注意事项：
1、客户需自己准备兔来源的一抗。
2、使用Blocking Buffer封闭液、Antibody Pretreat Solution(HRP/Rabbit)抗体反应液(兔)、Wash Buffer(10×)漂洗液之前请充分混匀。
3、漂洗液如在2～8℃保存时出现沉淀，请恢复到室温，把沉淀溶解后正常使用，1×漂洗液可在室温保存一个月。
4、建议转膜完成后用丽春红等试剂染色，并把膜上多余部分剪去以增加试剂的使用效率。
5、一抗和抗体反应液HRP(兔)需要通过预实验来确定最佳的稀释用量。
6、抗体反应液HRP(兔)、抗体稀释液和抗体用量可根据膜的大小按比例放大或减少。
7、加入一抗的抗体稀释液可以回收重复使用一次。特异性及亲和力低的抗体不建议重复使用。回收后抗体如在1-2天内使用放置在2～8℃，长期保存请在-20℃冻存，避免多次反复冻融。
8、如果存在较高背景的情况，请调整抗体的用量，并增加洗膜次数。
9、试剂盒内所有试剂请于2～8℃保存，避免冻融。

操作步骤：
本产品适用于转膜完成后的封闭及抗体孵育步骤，以5cm×8cm 膜为例：

1、漂洗液准备：取10ml Wash Buffer(10×)用蒸馏水稀释至100ml，即为1×Wash Buffer，待用。每次洗膜用8-10ml。
2、封闭：转膜完成后，将膜浸没到10ml Blocking Buffer中，室温封闭5分钟。
3、漂洗：倒掉封闭液，加入8-10ml 1×Wash Buffer，于摇床上用较大速度漂洗1分钟。
4、洗膜的同时可准备抗体孵育液：取Antibody Pretreat Solution(HRP/Rabbit)100μl到离心管中，加入兔源一抗3-10μg，枪头吸打至充分混匀，室温孵育5分钟。加入至10ml Dilution Buffer中，充分混匀。
注意：
1)一抗的用量也可根据抗体的稀释度来进行调整。以抗体的最终稀释度1:1000为例，取100μl抗体反应液HRP(兔)到EP管中，加入10μl一抗，加入到10ml 抗体稀释液中，充分混匀，室温孵育5分钟。
2)如果膜面积较小，可按比例减少抗体、反应液及稀释液的用量。
5、完成步骤3后，倒掉漂洗液，将一抗、Antibody Pretreat Solution(HRP/Rabbit)及Dilution Buffer混合而成的抗体孵育液加到膜上(确保孵育液完全浸没膜表面)，在摇床上以60 rpm左右的速度室温孵育40分钟。
6、弃去(回收)抗体孵育液，用配制的1×Wash Buffer漂洗3-5次，每次3分钟。
7、进行后续检测。建议采用ECL或者DAB法进行检测。

应用实例：


实例一 抗原为293T细胞全裂解液
A：普通WB对照：beta-actin兔多抗 3.3ug 室温孵育40min，洗膜后二抗羊抗兔-HRP(WE0394)1：10000稀释，室温40min，ECL(WE0308)曝光


实例二 抗原为293T细胞全裂解液
C：普通WB对照：PAK1，Epitomics兔单抗1：1000 室温孵育40min，洗膜后二抗羊抗兔-HRP(WE0394)1：10000稀释，室温40min，ECL(WE0308)曝光
D：一步法WB： Epitomics兔单抗1：1000 室温孵育40min，ECL(WE0308)曝光。

常见问题及解决方法：

问题	可能原因	解决方案
信号太弱或者 看不到条带	蛋白上样量太少	进行SDS-PAGE电泳时加大上样量。
	蛋白转膜效率太低	优化转膜时间或者电流，确保转膜时膜与胶之间没有气泡。
	一抗亲和力较低	增加膜在溶液中的孵育时间或者增加抗 体浓度可以增加信号
	一抗亲和力较低	对于低亲和力抗体来说，减少洗膜时间可以增加信号。由每次10 分钟，减少到每次5分钟可以增加信号。
背景偏高	一抗使用过量	减少一抗的使用量。
	一抗有非特异性结合或者 与封闭试剂有交叉反应	使用和二抗来源一致的血清或者无IgG的BSA。
	洗膜时间太短	增加洗涤的步骤可以进一步的降低背景。
	曝光显影时间过长	减少曝光时间。如果信号和背景都高，可以等待一段时间 ，等背景信号减弱后，再进行曝光。
	容器或者试剂被污染	每次洗涤的时候使用清洁的容器。带手套，使用清洁的镊子处理膜。

储存条件：2～8℃保存，避免冷冻

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·UltraStain核酸染料
编号：WE0210
英文名称：UltraStain Nuclear Dye
规格：500μl
  UltraStain是一种生物大分子，不能穿透细胞膜进入细胞内。相对于EB的强诱变性，是一种安全无毒的核酸染料。UltraStain与EB具有相同的光谱特性，无需改变滤光片及观察装置，在正常紫外光激发检测即可，集无毒性、高灵敏性和高稳定性等优点于一体，可以选择胶染法或泡染法进行染色，使用非常方便和灵活。

自备试剂：琼脂糖，TAE/TBE电泳缓冲液(WE0216S/WE0215S)

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、使用泡染法染色时，染料用量较多，单次使用的染色液可重复使用3次左右。3×染色液可以大量制备，在室温下避光保存。
2、如果总是看到条带弥散或分离不理想，建议使用泡染法染色以确认问题是否与染料有关。如果染色后问题依旧存在，则说明问题与染料无关，请尝试：选择合适的琼脂糖浓度；选用更长的凝胶；延长凝胶时间以保证边缘清晰；减少DNA上样量(推荐上样量为50-200ng/泳道)。

操作步骤：
1、胶染法
向琼脂糖溶液中加入UltraStain(10000× in Water)至终浓度为1×(如琼脂糖溶液为50ml，则加入5μl染料)，并充分混匀。待凝胶凝固后，按照常规方法进行电泳和图像采集。
注意：由于UltraStain具有良好热稳定性，可以直接添加到热的琼脂糖溶液中而不需要等待溶液冷却。摇晃，振荡或者翻转以保证染料充分混匀。也可以选择将UltraStain加到琼脂糖粉末和电泳缓冲液中，然后用微波炉或其他常用方式加热以制备琼脂糖凝胶。
2、泡染法
1)配置不含染料的琼脂糖凝胶， 按照常规方法进行电泳。
2)用H2O将UltraStain(10000× in Water)稀释约3,300倍到0.1M NaCl中，制成3×染色液，如将15μl UltraStain(10000× in Water)和5ml 1M NaCl加到45ml H2O中。
3)将凝胶小心地放入合适的容器中，缓慢加入足量的3×染色液浸没凝胶。室温振荡染色30 min左右，最佳染色时间根据凝胶厚度以及琼脂糖浓度不同而略有不同。按照常规方法进行图像采集。


图为Super DNA Ladder(货号：WE0243)在含有UltraStain染料的琼脂糖凝胶中的电泳图

储存条件：室温避光


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·高效多重PCR Mix
编号：WE0124
英文名称：Super Multiplex PCR Mix
规格：1ml|5ml
  本品是由SuperStar DNA Polymerase、Mg2+、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂等组成的预混体系，专用于多重PCR扩增。本品所含的 SuperStar DNA Polymerase是全新高效热启动酶，在常温下没有聚合酶活性，可有效减少PCR反应初期因引物错配而产生的非特异性扩增。独特的缓冲体系与热启动酶的组合，显著提高了PCR的扩增效率，扩增范围更广泛。本产品适用于各种类型的多重PCR反应，比如微卫星分析、基因分型和SNP检测等。

产品组成：

组份	1ml	5ml
2×Super Multiplex PCR Mix	1ml	5×1ml
ddH2O	1ml	5×1ml

注意事项：
1、使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、避免反复冻融，反复冻融可能使产品性能下降。如果在短期内需要频繁使用，可在2～8℃保存。

使用方法：
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系
2×Super Multiplex PCR Mix	25μl
Primer Pool	0.1-0.3μM
DNA or cfDNA	5ng-100ng
ddH2O	up to 50μl

注意：引物浓度请以终浓度0.1-0.3μM作为设定范围的参考。

2、PCR反应条件

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	2 min
变性	98℃	20 s	30-40个循环
退火延伸	65℃	90 s
终延伸	72℃	5 min

注意：
1)一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。


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·低背景ECL化学发光检测试剂盒
编号：WE0307
英文名称：cwECL Western Blot Kit
规格：50ml|250ml
  低背景化学发光检测试剂盒是免疫印迹实验中与辣根过氧化物酶(HRP)配套使用的的低背景底物检测试剂盒。本产品能够在HRP的催化下发生化学反应而发光，可用于检测固定在膜上的蛋白质等生物大分子。其高灵敏度能够检测ng级别的抗原，发光信号强
烈持久，可以使用照相技术(X-光胶片曝光)或者其他成像方法(如荧光或化学发光成像仪)进行检测。

试剂盒组成：

组成	50ml	250ml
cwECL-A(Luminol)	25ml	125ml
cwECL-B(Peroxide)	25ml	125ml

注意事项：
1、在与膜发生接触过程中，请佩戴手套且使用干净镊子等洁净器材，避免蛋白污染及高背景。
2、避光条件下，配制好的化学发光检测底物工作液可在室温下稳定保存8小时。阳光或其他强光会影响工作液，故应避免强光长时间的照射。正常实验室灯光短时间照射不影响工作液的使用。
3、百奥莱博提供多种蛋白转移用膜、封闭液、一抗、酶标二抗、缓冲液等，详情请查询公司网站。

操作步骤：
1、二抗孵育完毕后，将印迹膜充分洗涤。
2、根据需要量，将cwECL-A和cwECL-B按照1：1的比例等体积混合，配制为发光检测底物工作液(一张8 cm×6 cm的膜大约使用1ml工作液)。
3、弃去洗涤缓冲液，将发光底物工作液滴加在印迹膜上，确保工作液覆盖整张膜，室温孵育3-5分钟。
4、用移液器吸去多余发光底物工作液，将印迹膜置于两层干净的塑料薄膜之间，此过程应小心完成，避免膜与膜之间产生气泡。
5、在暗室内进行X-光胶片曝光，或将膜放置到化学发光成像仪内，按照仪器说明书进行检测。
 

问题	可能原因	解决方法
胶片反相(白色条带，黑色背景)	系统中HRP过量	稀释HRP标记物至少10倍以上
膜上出现棕色或黄色条带
暗室中看到强烈发光
发光信号持续时间过短
信号较弱或者无信号	发光反应系统中HRP 过多，消 耗底物过快，引起信号迅速降低	稀释HRP标记物至少10倍以上
	抗原/抗体量不够	增加抗原/抗体使用量
	蛋白转移率低	优化转移系统
高背景	系统中HRP 过量	稀释HRP标记物至少10倍以上
	封闭不足	优化封闭程序
	封闭试剂选择不当	选择另一种封闭试剂
	冲洗不充分	增加冲洗时间，次数
	曝光过度	减少曝光时间
	抗原/抗体浓度过高	降低抗原/抗体使用浓度
蛋白条带为点状	蛋白转移失败	优化转移过程
	膜未平衡	按照说明书处理膜
	胶片与膜之间有气泡	曝光前去除所有气泡
出现非特异条带 (高背景、信号维持时间较短)	系统中HRP过多	稀释HRP标记物
出现非特异条带 (背景干净信号维持时间正常)	一抗用量过多	进一步稀释一抗
	SDS 导致非特异结合	在实验过程中避免使用SDS

储存条件：2～8℃，避光保存

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