一站式蛋白质非变性PAGE电泳套装(低pH) 蛋白质研究

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

百奥莱博专业生产销*(代"售")一站式蛋白质非变性PAGE电泳套装(低pH) 蛋白质研究，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：一站式蛋白质非变性PAGE电泳套装(低pH) 蛋白质研究
编号：BTN81212C
规格：30次
英文名：One-Stop Protein Native PAGE Pack(C)
品牌：百奥莱博
产地：北京
非变性聚丙*(代"烯")酰胺凝胶电泳(Native PAGE)是目前电泳法分离活性蛋白的主要方法之一，跟SDS-PAGE根据分子量大小分离蛋白质不同，它是根据蛋白质分子大小、形状、电荷密度三个主要参数分离蛋白质。由于蛋白质的pI各不相同，所以对不同蛋白质需要选用具有不同pH的电泳体系。单独配制不同pH的Native PAGE电泳胶十分繁琐，为此本公司开发了本产品。

产品特点：
1．即开即用，不需单独准备各种成分，十分方便。还免去了实验人员接触粉末状的剧毒物品丙*(代"烯")酰胺
2．非变性，电泳过程中蛋白质保持天然的构象和亚基之间的相互作用，得到的蛋白质一般都具有生物活性(而SDS-PAGE得到的蛋白没有活性)。
3．可用于分析蛋白质和DNA或RNA的相互作用、蛋白修饰、蛋白构型改变、回收有活性蛋白质等试验。
4．电泳后可直接用于考染、银染、Western杂交等实验。
5．提供具有3种不同pH的缓冲液套装，便于客户选择最适合的缓冲液体系。

产品组成：

 

成分	规格
丙*(代"烯")酰胺干粉	60g
甲叉双丙*(代"烯")酰胺干粉	3g
TEMED	1.5ml
过硫*(代"酸")铵干粉	1g
高中低缓冲液套装选一	ABC之一(见下)
说明书	1份
高pH缓冲液套装(只有BTN81212A有此成分)
高pH浓缩胶配胶液(pH6.7)，4×	100ml
高pH分离胶配胶液(pH8.9)，4×	200ml
高pH电泳液(pH8.3)	10L(干粉)
高pH上样液，5×	1ml
中pH缓冲液套装(只有BTN81212B有此成分)
中pH浓缩胶配胶液(pH5.5)，4×	100ml
中pH分离胶配胶液(pH7.5)，4×	200ml
中pH电泳液(pH7.0)干粉A	55.2g
中pH电泳液(pH7.0)干粉B	10g
中pH上样液，5×	1ml
低pH缓冲液套装(只有BTN81212C有此成分)
低pH浓缩胶配胶液(pH6.7)，4×	100ml
低pH分离胶配胶液(pH4.3)，4×	200ml
低pH电泳液(pH4.5)	10L(干粉)
低pH上样液，5×	1ml

注：高、中和低pH缓冲液套装里面均含100mL浓缩胶配胶液、200mL分离胶配胶液、10 L电泳液(干粉)和1mL上样液，只是pH不同。

储存条件：常温运输和保存(上样液需-20℃保存)，保存期为一年。

使用方法：
如何选择缓冲液?
高pH浓缩胶，高pH分离胶，高pH电泳液和高pH上样液一定要配套使用。中pH和低pH系列也是如此，绝不能高pH的成分跟其他pH的交叉使用。选择适当pH的缓冲液(包括上样液，电泳液，配胶液等)对蛋白质非变性PAGE非常重要，缓冲液的最佳pH又跟目的蛋白质的pI值密切相关。如果pH远离pI，则蛋白质分子带电多(电荷密度大)，电泳速度快，分辨率高。但过酸过碱又容易使蛋白质结构变性，失去活性，所以最佳pH条件就是在电泳分辨率和维持活性之间寻找平衡，需要针对每种蛋白质进行摸索或通过滴定曲线来确定，没有通用的电泳缓冲体系。由于有近半数的蛋白质pI在4-6.5，所以在不知道目标蛋白的pI时，可以先选用高pH缓冲系统。

一、配制分离胶
1．确定浓度。对分子量在100Kd以上的蛋白质，可选用3-5%的胶；对分子量在20-150KD之间的蛋白质，可选用5-10%的胶；对分子量在10-80KD之间的蛋白质，可选用10-15%的胶。对未知样品，建议使用7.5%的胶。
2．配制10%的APS(过硫*(代"酸")铵)：按每0.1克过硫*(代"酸")铵干粉加1mL去离子水的比例配制10%的APS溶液，该溶液可以在4℃存放一周。
3．配制30%丙*(代"烯")酰胺-甲叉双丙*(代"烯")酰胺(19:1)溶液:在本产品提供的装有60克丙*(代"烯")酰胺干粉的塑料瓶中加入146mL自备的去离子水和3g甲叉双丙*(代"烯")酰胺,充分摇晃直到溶解(约需10-20分钟)即得200mL 30%丙*(代"烯")酰胺(19:1)溶液。此溶液最好在一个月内用完，必须4℃避光保存。
4．配10mL分离胶(如果配制其他体积,请按比例调节各成分用量):在一个25mL的三角瓶中，先加入4.2mL去离子水、3.3mL 30%丙*(代"烯")酰胺-甲叉双丙*(代"烯")酰胺(19：1)溶液和2.5mL 4×分离胶配胶液。
5．摇晃混匀后抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气(氧气能抑制丙*(代"烯")酰胺聚合反应，不去除的话将影响丙*(代"烯")酰胺聚合反应)。
6．加入50μL新配制的10%APS和10μL TEMED(这是配制10mL胶的用量，配制更大体积的胶则按比例增加)，迅速摇匀后倒胶。注意：如果购买的是低pH缓冲系统，由于在低pH缓冲液中PAGE聚合速度降低，所以需要增加上述两成分的用量。
7．在胶面距离顶部1-1.5 cm的时候停止灌胶。然后覆盖一层1-5 mm厚的水，使胶顶部液面平整。由于比重不同，水和丙*(代"烯")酰胺溶液不会混合。
8．室温聚合30-60分钟后，用1×分离胶配胶液洗涤凝固的胶的顶部，待用。

二、配制浓缩胶(浓缩胶可以提高分辨率，适合于成分复杂的样品，一般使用浓度为4%。使用浓缩胶时蛋白质泳动速度主要跟其尺寸和形状相关。因浓缩胶pH跟分离胶pH不同，蛋白质可能会发生聚合和沉淀。对成分单一的样品，可以不用浓缩胶，此时蛋白的泳动速度主要跟其电荷密度，尺寸和形状相关。)
1．配10mL浓缩胶(如果配制其他体积,请按比例调节各成分用量):在一个25mL的三角瓶中，先加入6.2mL去离子水、1.3mL 30%丙*(代"烯")酰胺-甲叉双丙*(代"烯")酰胺(19：1)溶液和2.5mL 4×浓缩配胶液。
2．摇晃混匀后抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气(氧气能抑制丙*(代"烯")酰胺聚合反应，不去除将影响丙*(代"烯")酰胺聚合反应)。
3．按上表用量加入50μL 10%APS和15μL TEMED(这是配制10mL胶的用量，配制更大体积的胶则用量需按比例增加)，迅速摇匀后在已经凝固的分离胶上倒胶。
4．在液面达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
5．室温聚合30-60分钟，拔出梳子，用1×电泳液冲洗加样孔。

三、电泳
1．将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽加入足够1×电泳液。注：本产品提供10升的三种不同pH的电泳液干粉中的一种，低PH和高PH值电泳液用前需将所有干粉溶解在1 L水中得10×电泳液，可以室温放置，用时再稀释成1×电泳液。一般不需要再调节pH，但保险起见，可以用pH试纸测试一下1×电泳液。高中低pH电泳缓冲液的pH分别是8.3，7.0和4.5。
 注意：中pH值的电泳液干粉只能配1x电泳液，否则不溶解。称取中pH电泳液(pH7.0)干粉A，5.52g,中pH电泳液(pH7.0)干粉B 1g混匀，加去离子水至彻底溶解，调PH7.0，定容至1L。客户根据可实际需要量按比例增减。
2．连接电极。如果浓缩胶和分离胶的pH高于目标蛋白pI，目标蛋白将带负电荷并向阳极移动，可以按标准的SDS-PAGE方法接通电极(上阴极下阳极)；如果浓缩胶和分离胶pH低于目标蛋白pI，目标蛋白将带正电荷并向阴级移动，此时应该下阴极上阳极。
3．300V预电泳直到电流不再降低(约需要30分钟)以去除残留过硫*(代"酸")铵。
4．换电泳液。
5．在液体蛋白质样品中加入5×上样液(16μl液体样品加4μL上样液)后上样。0.75 mm厚的胶可以上10μl，1.5 mm厚的胶可以上20μl。在未用加样孔中也要加1×上样液以防有样品的空道的样品扩散。注意：如果用考染检测，每个孔的蛋白最好在50-100μg总蛋白，如果银染则只需要1ug即可。样品如果是蛋白质沉淀，可用1×上样液直接溶解蛋白质沉淀后再上样。蛋白质溶液或沉淀中不能含有能够改变上样液pH的残留成分(如蛋白质沉淀剂TCA)，用前最好用pH试纸测试一下，不在上样液的pH范围时就用酸或碱调到正常范围。大量样品可用透析法调pH。
6．上样自备的天然PAGE蛋白质标准或等电电泳的标准品(如果有的话)。
7．用15 mA(对0.75 mm厚的胶)或30mM(对1.5mm厚的胶)的电流电泳直到染料移动到分离胶底部。微型胶一般需要1-2小时。注意：电泳过程最好在冷室或有冷却系统，以免电泳产热使蛋白质变性。
8．终止电泳，取出凝胶进行后续的实验处理(如染色或酶活性检测)。

关于一站式蛋白质非变性PAGE电泳套装(低pH) 蛋白质研究的更详细说明，请致电我公司咨询，我们将以最饱满的热情为您提供解答，此外，我公司专业供应下列产品：

·绿如蓝核酸染料(UV)
编号：BTN70303
英文名称：DNAgreen(UV)
规格：1.5mL
目前最常见的替代EB的核酸染料SYBR Green I(属于花*类染料)虽然毒性比EB低、灵敏度比EB高，但由于其化学稳定性差(怕光、怕水、怕热)，实验结果的重复性往往不尽人意；此外，SYBR Green I在电泳过程中能在DNA分子间移位，很容易使DNA 条带模糊和扭曲，电泳清晰度和分辨率也不如EB。所以在实际应用中依然不能有效替代EB。本产品是同时具有EB 稳定性和SYBR Green I低毒性的新性核酸染料

产品特点：
1.低毒。其主要成分未发现对人体有致癌性、未被列入有毒有害品，有利于保护使用者的健康和保护日益恶化的环境。
2. 灵敏。检测灵敏度跟EB相当，能满足常规核酸电泳实验要求。
3. 稳定。对光、水和热的稳定性跟EB相当，可加入琼脂糖凝胶中反复熔化。
4. 无分子间位移现象。不会出现SYBR染料常见的条带模糊和扭曲现象。
5. 使用方法多样。既可以加入熔化的胶中，也可以电泳后染色，还可用于PAGE。
6.跟各种常用的核酸电泳缓冲液(如SuperBuffer-2、TBE、TAE)兼容，但在SuperBuffer-2和TBE中背景最低。
7. 观察时不需要任何额外的仪器设备或UV光源，可以使用现成的观察EB的300nm UV。
8.可用于RNA染色(也呈绿色)。
9. DNA或RNA浓度较高时还可以直接在日光下观察(需要将胶放在黑色背景下)。由于避免了UV 对DNA的伤害，尤其适用于胶回收实验。

储存条件：常温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：
注意:虽然本产品的主要成分未发现对人体有致癌性、未被列入有毒有害品，但操作时最好还是戴上塑料手套。

使用方法之一：电泳中染色DNA(RNA的染色跟DNA完全一样)。
本方法是将DNAGREEN 直接加入溶化的凝胶中使用，只适用于琼脂糖凝胶电泳，不适用于PAGE。
1. 将DNAGREEN 直接加入到融化的琼脂糖凝胶中，每100mL凝胶加3-10μl DNAGREEN，混合均匀后倒胶。琼脂糖凝胶中不能含任何其他染料(如EB和SYBR Green I，否则会相互干扰)。在100mL 琼脂糖凝胶中加入DNAGREEN的量不要超过10μl，否则背景将很强。注意：一定要保证琼脂糖彻底熔化，尤其是在第一次熔化胶的时候，否则未熔化的小颗粒将产生跟染料相同的荧光。
2. 将DNA样品与DNA上样液按比例混合后上样。注意：一定要使用不含SDS等去污剂的上样液，否则SDS 会跟染料结合，极大地降低灵敏度。
3.上样后电泳，电泳参数同常规的电泳。如果使用百奥莱博五分钟核酸电泳液SuperBuffer-2，需要较高电压，详见该产品说明书。
4.电泳结束后在300nm左右的UV下观察。注意：不要使用波长为260nm或360nm的UV，否则检测灵敏度会降低。如果DNA或RNA浓度较高，还可以直接在日光下直接观察(需要将胶放在黑色背景下)，避免UV 对DNA的伤害，尤其适用于胶回收实验。
 注：显色结果：在紫外下，DNA浓度非常高的时候是白色，浓度低的时候是绿色的，单链核酸有时是红色的。
5. 用配置了520-550nm 滤光片(一般呈黄色或深黄色)的相机拍照。注意：不要使用与EB 兼容的红色滤光片(它能阻挡520-550nm的光)。如果能再加上能滤去UV的滤光片，效果会更好。
6.后续 Southern、转膜或DNA胶回收实验按常规操作进行。

使用方法之二：电泳后染色DNA
本方法是在电泳后对DNA进行染色，适用于琼脂糖凝胶电泳和PAGE。但该方法需要单独的染色处理，染料用量较大，不推荐用于琼脂糖凝胶的染色。
1. 按照常规方法进行电泳。
2. 用去离子水将DNAGREEN 稀释500倍后(100mL 水需要加0.2mL DNAGREEN)，将凝胶放入，室温下摇晃染色30分钟(对琼脂糖凝胶)或15分钟(对PAGE)。
3. 用水脱色 10-30分钟，具体时间需根据背景强弱决定，其余同方法一。
 注意：电泳后染色液可以反复使用次数。

疑难解答：
Q：本产品可否用于RNA染色？
A：可以，不论RNA是在甲醛变性胶中电泳，还是在普通的SuperBuffer-2、TBE或TAE胶中电泳，RNA染色后在300nm下都跟DNA一样呈绿色。
Q：本产品是否可以加入上样液中进行染色？
A：不行，本产品只能直接加入凝胶中进行染色或电泳后再染色。
Q：为何前端(靠近正极)的DNA 条带很淡或根本看不见？
A：跟EB一样，电泳时DNAGREEN 朝负极方向移动，当前端的DNA(最小片段)进入没有DNAGREEN的区域时，已经结合的染料分子会逐渐从DNA分子上脱落，所以条带会变淡或根本看不见。解决办法之一是缩短电泳时间或电泳后再染色；之二是在每100mL电泳缓冲液中补加3-5μL染料。
Q：本产品在哪种缓冲液中效果最好？
A：DNAGREEN染料在不同缓冲液中背景荧光强度不同，从弱到强的顺序是：
 SuperBuffer-2、TBE、TAE。在背景较强的缓冲液体中，可以适当降低染料的用量，比如100mL胶中加3-5μl。最佳浓度需要稍做摸索。
Q: 为何电泳后前面部分(靠近正极)的胶呈白色，后面的胶呈黑色？
A: DNAGREEN染料带正电，电泳时往上走，胶的黑色部分是染料上移后留下的无染料胶。
 本产品在TAE中背景最强，可参考上个问题答案更换电泳液以降低背景值。
Q：用SYBR染色的DNA在电泳时为何容易发生条带模糊和扭曲现象？
A：SYBR染料一般与DNA的小沟结合，但在常规电泳条件下该结合并不牢固，染料分子可以在标记的和未标记的DNA分子之间转移，使DNA分子的泳动速度时快(无染料结合时)时慢(有染料结合时)，发生条带模糊和扭曲现象。嵌入型染料(如EB和本产品)与DNA 结合牢固，则无此现象。
Q：核酸染料是否都有毒性？
A：核酸染料对动物和人的毒性由多方面决定。
 一是染料的膜通透性，EB 被归类为强诱变剂是由于其分子量较小，容易进入细胞内。而EB 二聚体Ethidium Homodimer(EthD)嵌入DNA的能力比EB 强上千倍，但毒性很小，就是由于其分子比EB大，不能透过细胞膜，所以毒性反而更低。SYBR 系列染料虽然低毒，但由于一般都溶于DMSO(因为容易水解，不能使用水溶液做溶剂)中，所以如果溅到皮肤表面，更容易进入皮肤。
 二是染料是否容易被人体降解。比如EB在体外就很难降解，一旦进入体内能在人体内残留的时间可能比较长，增加了毒性；而SYBR Green I等染料(也能以嵌入方式与DNA 结合)由于不稳定，比较容易自然降解，所以毒性自然较低。
 三是降解产物是否有毒性，比如用很多方法(如强碱法)降解EB 得到的产物有的比EB 毒性更大，而有的染料降解产物毒性却低很多，甚至无毒。
 四是染料进入细胞核以后是否能跟DNA 结合，很多实验结果显示即使EB染料也很难嵌入型到染色体中，因为染色体中的DNA 已经紧密地与各种组蛋白结合。
 五是细胞修复突变的能力，正常人体都有很强的修复突变的能力，如修复日光中UV 诱导的DNA突变。总之，一种DNA染料的毒性强弱是多种因素综合的结果。


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·8M盐*(代"酸")胍溶液
编号：BTN100408
规格：250mL

·DNA marker(200-5000bp)
编号：BTN70503S
英文名称：DNA ladder(200-5000bp)
规格：50次
 本系列产品用作凝胶电泳中双链线状DNA的分子量大小参照。它们是由一系列大小不同的单一DNA片段混合组成。成分中已经含有上样缓冲液，所以可以直接上样电泳。得到的电泳条带长度准确，明亮清晰，背景较低，稳定性很好。每次加样量为5μL，可用于相对定量。本系列产品与各种琼脂糖和各种电泳缓冲液兼容。

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

使用方法：直接上样电泳，每次加样量为5μL。

使用效果：

注：1500bp条带为20ng/uL,其余每条带为10ng/uL

疑难解答：
a)如对带型要求较高，建议使用0.8-1.5%琼脂糖凝胶(对SuperBuffer-2缓冲液，电压为250-400V)或1.5-2.0%琼脂糖凝胶(对TAE或TBE缓冲液，电压为80V)，同时适当延长电泳时间。
b)电泳图象的质量与琼脂糖、电泳缓冲液有关。请采用高质量的琼脂糖，同时要经常更换电泳缓冲液。
c)本产品条带均匀，亮度相当，但在EB胶中长时间电泳有可能会出现250bp以下的条带变淡。可以通过先电泳再染色，加大EB浓度等方法解决。


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BTN130904 超级杂交液(Oligo探针) Super hybrid solution(Oligo probe)
SV1568 *调素依赖型蛋白激酶 II（CaMK II）
SV0300 DdeI限制性内切酶 DdeI Restriction Endonuclease
WE0100 PCR Mix(含染料)(滴瓶装) PCR Mix(With Dye)
SY0760 DAB显色试剂盒黄色(IHC) DAB Peroxidase Substrate Kit for IHC (Yellow Color)
SY0072 MTF1-Luc荧光素酶报告基因质粒 MTF1 luciferase reporter plasmid
BTN131017 乙酰化牛血清白蛋白 Bovine Serum Albumin, Acetylated
KFS048 AMCA标记抗小鼠免疫荧光染色试剂盒 Immunol Fluorescence Staining Kit with AMCA-Labeled Goat Anti-Mouse IgG
SY0274 快速核酸银染试剂盒 Rapid Silver Stain Kit for Nucleic Acid
YT360 *离子荧光探针(MQAE) Chloride ion fluorescence probe
BTN120101 谷胱甘肽琼脂糖(GST-琼脂糖) Glutathione Agarose
HR0029 细胞膜蛋白提取试剂盒 Membrane protein extraction kit
YT623 30% Acr-Bis (29:1) acrylamide-bisacrylamide (29:1)
YT007 RNase A (10mg/ml) Ribonuclease A
BTN81104 超快核酸银染试剂盒 Rapid Silver Stain for Nucleic Acid

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