DAB显色试剂盒(WB IHC) 蛋白质研究

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博主要从事生物试剂的生产和销*(代"售")，产品线涵盖DAB显色试剂盒(WB IHC) 蛋白质研究在内的分子生物学试剂产品，还包括PCR及荧光定量PCR、核酸提取试剂盒类、样本核酸保护试剂、核酸提取、克隆与转化、蛋白纯化、蛋白检测、免疫组化、细胞凋亡与抗体等。

名称：DAB显色试剂盒(WB IHC) 蛋白质研究
品牌：百奥莱博
英文名：DAB Kit(20×)
编号：WE0323
规格：20ml|100ml
  DAB是HRP的常用底物，在辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生不溶于水和乙醇的棕色沉淀。该试剂盒适用于HRP系统的的免疫组化中的组织切片、细胞爬片以及Western Blot中PVDF膜、NC膜等的染色。辣根过氧化物酶可以催化底物DAB在目的蛋白所在的位置转变为褐色的化合物，可根据颜色反应来确定目的蛋白的位置及表达情况。

试剂盒组成：

 

组份	20ml	100ml
20×DAB-A	1ml	5ml
1×DAB-B	20ml	100ml

注意事项：
1、工作液现配现用，配制好的工作液2～8℃避光1小时内有效。
2、工作液用量必需充足，保证完全覆盖组织片或印迹膜。
3、显色后的组织切片或细胞爬片可用苏木精或甲基绿复染。
4、对于组织切片，以每张切片用50μl显色工作液计算，1ml 20×DAB为400张切片的用量，3ml为1200张切片的用量。
5、为获得最佳实验结果，请务必优化实验条件。
6、显色后若背景太深，可以考虑延长封闭时间，避免非特异性染色，或者缩短DAB的显色时间；显色后若显色太弱或没有显色，可以考虑增加一抗或二抗的浓度，或者适当延长显色时间。
7、DAB为可疑致癌物，使用时请采取必要的防护措施。
8、本产品仅用于科研，不能用于人体反应或人体治疗。

操作步骤：
1、DAB显色工作液配制：根据需要量，将20×DAB-A和1×DAB-B以1：19的体积比混匀后即为DAB显色工作液。也可选择每毫升DAB-B中滴加1滴(约50μl)DAB-A，混匀即可。
2、显色：
1)印迹膜显色：将配制好的工作液滴加在印迹膜上(或将印迹膜倾入到DAB工作液中)即可显色。显色时间一般为1-5分钟。显色完毕后，将膜浸入水中，终止反应。
2)组织切片或细胞爬片显色：加适量的DAB显色工作液于需要显色的组织切片或细胞爬片上即可显色，显色时间一般为1-5分钟。显微镜下观察控制显色时间，当达到最佳显色效果后，自来水冲洗终止显色。显色后的切片经复染、脱水透明，封片后可长期保存。

储存条件：2～8℃

欲了解更多DAB显色试剂盒(WB IHC) 蛋白质研究的品牌、产地、价格及说明书等产品信息，请致电北京百奥莱博科技有限公司，我们将竭诚为您服务，另外，以下产品正在火爆促销:

·FITC标记兔抗山羊IgG(H+L)
编号：WE0385
英文名称：Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated
规格：100μl
本产品为FITC标记的经亲和纯化的兔抗体，特异识别山羊IgG，检测灵敏度高，本底低，常用于免疫荧光和流式细胞等标记检测。

免疫原：山羊IgG
缓冲液：0.01M PBS，50%甘油，pH7.6
稳定剂：15 mg/ml BSA(不含IgG和蛋白酶)
防腐剂：0.05%叠氮*
荧光团：FITC，Amax=492; Emax=520
应用范围：Immunofluorescence(1：25-100)

·通用型柱式DNA提取试剂盒
编号：WE0190
英文名称：Universal Genomic DNA Extraction Kit
规格：50次|200次
  本试剂盒适合于从新鲜或冷冻的动物组织、细胞、血液、细菌等多种样品中提取高纯度总DNA。本品可纯化获得分子量最大为50 kb的DNA片段，纯化过程不需使用*酚或*仿等有毒溶剂，无需乙醇沉淀。本试剂盒采用优化的缓冲体系使裂解液中的DNA高效特异的结合到硅基质离心吸附柱上，PCR和其他酶促反应的抑制剂可通过两步洗涤步骤被有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可得到高纯度DNA。纯化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文库构建、Southern Blot、分子标记等下游实验。

试剂盒组成：

组份	50次	200次
Buffer GTL	15ml	60ml
Buffer GL	15ml	50ml
Buffer GW1(浓缩液)	13ml	52ml
Buffer GW2(浓缩液)	15ml	50ml
Buffer GE	15ml	60ml
蛋白酶K	25 mg	90 mg
蛋白酶K 储存液	1.25ml	5ml
吸附柱DM及收集管	50套	200套

自备试剂：无水乙醇，Enzymatic Lysis Buffer(提取革兰氏阳性菌基因组DNA时须准备)。
Enzymatic Lysis Buffe配方：20 mM Tris，pH8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2% Triton X-100；终浓度为20 mg/ml的Lysozyme(溶菌酶)。

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1．向蛋白酶K 中加入指定用量(1.25ml|4.5ml)的蛋白酶K 储存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
2、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
3、如果提取次生代谢产物大量积累或细胞壁厚的细菌培养物的基因组，建议在对数生长期早期收集样品。
4、第一次使用前应按试剂瓶标签的说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
5、使用前请检查Buffer GTL和Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer GL和Buffer GTL于56℃水浴重新溶解。
6、如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GL前加入4μl DNase-Free的RNase A(100 mg/ml)，RNase A 本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：WE0225S。

操作步骤：

一、血液及细胞样本基因组提取：
1、材料处理
a. 如果提取材料为哺乳动物抗凝血液(无核红细胞)，可直接向50-200μl新鲜或冷冻的抗凝血液样品中加入Buffer GTL补足至200μl；
b. 如果提取材料为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，取5-10μl新鲜或冷冻的抗凝血液样品，加入Buffer GTL补足至200μl；
c. 贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液(最大提取量为5×106个细胞)，2000rpm(400×g)离心5分钟，弃尽上清，加200μl GTL，振荡至样品彻底悬浮；注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100 mg/ml的RNase A溶液(货号：WE0225S)，涡旋15秒，室温放置2分钟。
2、加入20μl 蛋白酶K 。
3、加入200μl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，56℃水浴10分钟。
4、短暂离心以去除管盖内壁的水珠。加入200μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀，短暂离心。
注意：
1)加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2)加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。一些组织在加入Buffer GL和无水乙醇后可能形成溶胶状产物，此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。
5、上一个步骤中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm(～～13400 ×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7。
8、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
9、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μlBuffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：
1)如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)Buffer GE在65-70℃水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
3)如果要提高DNA的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟；若洗脱体积小于200μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg，推荐用50μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
4)因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。

二、动物组织基因组提取：

1、材料处理
 如果提取材料为动物组织，取25 mg(脾组织用量应少于10 mg)；如果材料为鼠尾，取一段长度为0.4-0.6 cm的大鼠鼠尾或两段长度为0.4-0.6 cm的小鼠鼠尾。
a. 样本进行液氮研磨或切成小块后置于1.5ml离心管中，加入180μl Buffer GTL，将不同样品做好标记。
b. 若使用匀浆器处理样本，匀浆前向样本中加入不超过80μl Buffer GTL，匀浆后加入100μl Buffer GTL。
注意：
1)确保各组织的量不要超出推荐范围。
2)组织样本在加入Buffer GTL之前用液氮研磨或加入Buffer GTL用匀浆器匀浆处理，可以增加裂解效率。
2、加入20μl 蛋白酶K ，涡旋震荡使样品彻底混匀。56℃水浴，直至组织完全裂解，孵育过程中可每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样品分散。
注意：
1)不同组织消化时间不同，通常1-3小时即可完成，鼠尾需要消化6-8小时，必要时过夜消化，不会影响后续操作。
2)如果孵育和涡旋震荡后仍然有胶状物质，延长56℃孵育时间或再加入20μl 蛋白酶K 消化。
3)如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl的浓度为100 mg/ml的RNase A溶液(货号：WE0225S)，涡旋15秒，室温放置5-10分钟。
3、加入200μl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，70℃水浴10分钟。短暂离心后加入200μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。
注意：
1)加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2)加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。一些组织(如脾，肺)在加入Buffer GL和无水乙醇后可能形成溶胶状产物，此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。
4、短暂离心，将步骤3所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm(～～13400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤6。
7、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
8、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μlBuffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：
1)如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)Buffer GE在65-70℃水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200μl BufferGE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
3)如果要提高DNA的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟；若洗脱体积小于200μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg，推荐用50μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
4)因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。

三、细菌基因组提取：
1、细菌样本预处理
a. 革兰氏阴性菌
①取细菌培养物1-5ml(106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞)置于离心管(自备)中，12000rpm(~～13400 ×g)离心1分钟，尽量吸净上清。
②向沉淀中加入180μl Buffer GTL，振荡使菌体重悬。
③加入20μl 蛋白酶K ，涡旋混匀，56℃孵育，直至菌体完全裂解，孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样本分散。
注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液(货号：WE0225S)，震荡混匀，室温放置5-10分钟。
④加入200μl Buffer GL，涡旋震荡混匀。
b. 革兰氏阳性菌
①取细菌培养物1-5ml(106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞)置于离心管(自备)中，12000rpm离心1分钟，尽量吸净上清。
②加入180μl Enzymatic Lysis Buffer(自备)使菌体重悬。
③37℃孵育30分钟。
④加入20μl 蛋白酶K 涡旋震荡，充分混匀。加入200μl Buffer GL，涡旋震荡混匀。56℃孵育30分钟。
注意：
1)如果需要，95℃孵育15分钟可以使病原体失活，但是95℃孵育会造成一些DNA的降解。
2)如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液(货号：WE0225S)，震荡混匀，室温放置5-10分钟。
2、加入200μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。
注意：加入无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。
3、将步骤2所得溶液(包括形成的沉淀)全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
4、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤5。
6、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
7、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μlBuffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：
1)如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)Buffer GE在65-70℃水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
3)如果要提高DNA的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟；若洗脱体积小于200μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg，推荐用50μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
4)因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。

储存条件：室温(15～30℃)。


DAB显色试剂盒(WB IHC) 蛋白质研究关键词：WB IHC,DAB显色试剂盒,WE0323,DAB Kit(20×),DAB显色试剂盒(WB IHC)

血清/血浆游离DNA提取试剂盒 
ZCXQ02 兔血清 500ml
BL0010 水解乳蛋白 BactoTM TC Lactalbumin Hydrolysate
BTN130831 丝状真菌线粒体DNAOUT Filamentous Fungal mtDNAOUT
ARB11373 人前列腺素F2A(PGF2A)elisa测定使用说明书 Human prostaglandin f2α,pgf2α ELISA KIT
脱氧核糖核酸酶Ⅱ(猪脾) Span 20 9025-64-3
BTN81220 柱式昆虫RNAOUT Column Insect RNAOUT
HC0328 单道雷勃彩色移液器(全彩)
ARB13124 小鼠促卵泡素(FSH)ELISA检测服务 Mouse follicle-stimulating hormone,fsh ELISA KIT
ARB13913 猪抗凝血酶受体(ATR)含量分析 Porcine anti-thrombin receptor,atr ELISA KIT
HEPES-BSA溶液(HA溶液)   100ml
PY01-038  盐*(代"酸")噻胺(VB1)  5|25克  
CBZ-L-亮*酸 Chlormequat chloride 2018-66-8
ARB10309 人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)ELISA代测服务 Human macrophage migRation inhibitory factor,mif ELISA KIT
BL1412 "Western blotting(小鼠/兔IgG)
SJ0675 Marker Ⅰ
ARB12932 小鼠对*基*甲*(代"酸")(PABA)Elisa分析 Mouse para-aminobenzoic acid,paba ELISA KIT
CYB166002-D 羊抗人IgG-GOLD
ARB13313 山羊丙*(代"酮")(Acetone)酶标法分析 Goat acetone ELISA KIT
ARB13184 小鼠胰岛素受体β(ISR-β)血清中含量检测 Mouse insulin receptor β,isr-β ELISA KIT
荧光示踪灌注固定液   500ml
DAB显色试剂盒(WB IHC) 蛋白质研究关键词：WB IHC,DAB显色试剂盒,WE0323,DAB Kit(20×),DAB显色试剂盒(WB IHC)


·FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)
编号：WE0384
英文名称：Goat Anti-Rabbit IgG, FITC Conjugated
规格：100μl
本产品为FITC标记的经亲和纯化的山羊抗体，特异识别兔IgG，检测灵敏度高，本底低，对其他种属IgG无明显交叉反应，常用于免疫荧光和流式细胞等标记检测。

免疫原：兔IgG
缓冲液：0.01M PBS，50%甘油，pH7.6
稳定剂：15 mg/ml BSA(不含IgG和蛋白酶)
防腐剂：0.05%叠氮*
荧光团：FITC，Amax=492; Emax=520
应用范围：Immunofluorescence(1：25-100)

·TA快速连接试剂盒(pUC-T Simple)(含载体，连接酶)
编号：WE0247
英文名称：pUC-T Simple TA Cloning Kit
规格：20次
  pUC-T Simple载体是一种高效克隆PCR产物的专用载体，它是由pUC18载体在EcoR V酶切位点处切开，在两侧的3＇端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3＇端添加一个A，可以与pUC-T 3＇端的T互补连接，同时它消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行DNA酶切时，酶切反应将不会受到T载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响，可以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。
  试剂盒中配备高效率的T4 DNA Ligase和为快速高效DNA连接优化的2×Quick Ligation Reaction Buffer。连接效率相当于用T4 DNA Ligase 进行常规连接1小时。带有插入片段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入。克隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物对PCR产物进行测序。

试剂盒组成：

组份	20次
pUC-T Simple(50 n g/μl)	20μl
Control Insert(50ng/μl)	10μl
Quick T4 DNA Ligase	20μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	120μl

注意事项：

1、Insert DNA 要求
1)连接使用的PCR片段3’末端应带有“A”尾。有些高保真DNA聚合酶，如我公司的Pfu扩增的PCR产物是平滑末端，可使用加A试剂盒加上A尾后，再进行T载体克隆。
2)PCR产物建议进行切胶回收纯化后再进行T载体克隆，以免PCR产物中的非特异片段或残存引物等杂质影响。推荐使用WE0168快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

2、连接反应要求
1)本试剂盒能使大多数连接反应在25℃条件下5分钟甚至更短时间内达到反应终点，增加反应时间反应效率不会增强。如用快速连接反应1小时后，转化效率会明显降低；如25℃快速连接反应过夜，则转化效率会下降到75%。
2)2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP，使用前置于冰上使其融化后充分混匀，建议初次使用分装成小管冻存，避免其反复冻融影响DNA连接效率。
3)由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比较粘稠容易挂壁，建议使用之前短暂离心将液体收集到管底，取样时枪头尽量不要深入液面太深，以免粘在枪头上造成损失。
4)如快速连接产物用于电转，因快速连接反应体系中的PEG会影响电转效率，建议使用离心柱将连接产物进行DNA纯化(如WE0170快速DNA产物纯化试剂盒)后再进行电转。

3、感受态细胞要求
建议使用高效的热击转化感受态细胞，这样才可能得到比较理想的阳性克隆，如需进行蓝白筛选，宿主细胞必须具有正确的基因型(F´编码的【lacZ ΔM15】)产生ω片段，才能与载体DNA产生的LacZ α 多肽结合，表现出β-半乳糖苷酶活性(α互补)。pUC-T Simple载体以pUC18载体为基础构建而成，因此，适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用。推荐使用本公司WE0251 TOP10感受态细胞、WE0252 DH5α感受态细胞。

4、阳性克隆筛选
阳性DNA片段成功插入至pUC-T Simple Vector中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。

5、阳性对照
为了确认实验操作的正确性，以及实验试剂的有效性，我们建议使用本试剂盒中配备的Control Insert(750 bp)进行阳性对照实验。

使用方法：

1、按以下体系配制反应液：

成分	反应体系	对照体系
pUC-T Simple(50ng/μl)	1μl	1μl
DNA 插入片段 *	0.1 -0.3 pmol	--
Control Insert DNA	--	1μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	5μl	5μl
Quick T4 DNA Ligase	1μl	1μl
RNase-Free Water	补足至10μl	补足至10μl

Insert DNA的使用量：在进行克隆时，Vector DNA和 Insert DNA的摩尔比一般为：1:2-1:10，可根据实验情况选择适当的Vector DNA和 Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA的使用量=nmol数×660×Insert DNA bp数。本载体1μl(50ng)的摩尔数约为0.03 pmol。

2、轻轻混合，短暂离心。25℃反应5分钟。
注意：反应时间不要超过15分钟，否则会降低连接效率。
3、反应结束后，将DNA连接产物存放于0-4℃，而后进行转化实验；也可将DNA连接产物置于-20℃保存。
注意：勿进行加热失活反应。
4、将连接产物加入50μl感受态细胞中(将感受态细胞置于冰上融化)，冰浴30分钟。
注意：用化学法转化时，连接产物的加入量不要超过感受态细胞体积的10%。
5、42℃热击45秒钟，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
6、加入450μl无菌SOC或LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟，使菌体复苏。
7、根据实验要求，取适量已转化的感受态细胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固体培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃，直至液体被吸收后，倒置培养，37℃培养12-16小时。
8、计算白、蓝色菌落，挑选白色菌落，使用PCR法或酶切法鉴定插入片段是否正确。




储存条件：-20℃。

我公司强烈推荐蛋白质研究系列产品，热情期待您的咨询选购DAB显色试剂盒(WB IHC) 蛋白质研究。