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- 2025年11月25日
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2）不同浓度的PMA刺激后人T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入不同浓度的PMA（10ng、20ng和50ng终浓度）和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血单个核细胞，同时加入0.7µl Golgistop，37 ℃ CO2孵箱刺激4h。收集单个核细胞，分为三部分，分别加入CD8-CYC、CD4-CYC、CD3-APC单抗各10μl，室温避光孵育30min。加入红细胞裂解液（FACS Lysing Solution）1ml裂解残余红细胞，2ml PBS洗涤细胞一次。流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson）检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞，每个检测获取10000个细胞。采用前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以直方图分别表示CD3、CD8和CD4阳性淋巴细胞。
3）不同时间PMA和离子霉素刺激后小鼠T淋巴细胞CD4和CD8的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入PMA和Ionomycin使终浓度分别为100ng/ml和1µg/ml，同时加入0.7µl Golgistop。37 ℃ CO2孵箱刺激8h、12h分别收集细胞。采用抗小鼠CD4-CYC、CD8PE抗体标记T淋巴细胞，流式细胞仪检测CD4和CD8的表达。
4）流式细胞术检测人外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入20ng/ml PMA和500ng/ml 离子霉素刺激4h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，分别加入CD3-APC，CD8-PercP10µl，混匀，室温放置20min，加入红细胞裂解液1ml，混匀，室温放置10min，1000g离心5min，弃上清。加入Cytofix/Cytoperm液200µl，4℃放置20min，使细胞固定穿孔。加入Perm/Wash液1ml，1500g离心5min，弃上清。实验管加入IFN-γ-FITC、IL-4 - PE各5μl，对照管加入同型对照抗体，4℃避光孵育30min。加入Perm/Wash液500µl洗涤两次。最后以300µl洗涤液重悬细胞。采用FACScom软件及CD3-APC、CD8-PercP 、IFN-γ-FITC、IL-4 – PE抗体单双标记的淋巴细胞调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD3和CD8散点图设门区分Th细胞（CD3+CD8-）。最终以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。
5）流式细胞术检测小鼠外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入100ng/ml PMA和1µg/ml 离子霉素刺激5h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，加入CD4－CYC 10µl，混匀，其余步骤同人的检测。调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD4直方图设门区分Th细胞（CD4+），以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。
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文献和实验为研究免疫细胞的功能，常需高纯度的淋巴细胞或其亚群，分离方法介绍如下。 一、纯淋巴细胞群的采集 通常利用单核细胞在37℃和Ca 2+ 存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核细胞悬液中去除单核细胞的方法，藉以获得高纯度的淋巴细胞群。 （一）粘附贴壁法 将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶
讨 论 1.小鼠生殖细胞单细胞悬液制备的影响因素 良好单细胞悬液的制备必须首先考虑所用小鼠的日龄。因为随动物日龄的增加，精原细胞开始分化形成各级生殖细胞，其绝对数目及所占生殖细胞的比例都逐渐下降，会给分离纯化增加困难。在成年小鼠的睾丸中，A型精原细胞只占所有精原细胞的1.25%，占未分化精原细胞的10.6%，仅占所有生殖细胞的0.03%［5］ 。因而用来分离精原细胞的动物的日龄应较小为好。一般小鼠选用生后8d的［2］ ，但也有人选用生后10d的；大鼠则选用生后9d的［6］
从单个小鼠肿瘤样本中分选高纯度、高活性 TIL 细胞亚群的完整工作流程
TIL 细胞分选工作流程，解决实验瓶颈：即如何将小鼠肿瘤组织高效的分离成单细胞悬液、磁珠预富集 CD45+ TIL 细胞，然后从同一样品中依次分选高纯度和高活性的 TIL 细胞亚群。 分离高纯度、高活性的 TIL 细胞亚群的工作流程 1. 肿瘤分离 利用带有加热装置的八通道全自动组织解离器 gentleMACSTM Octo 和小鼠肿瘤分离试剂盒分离 1g 小鼠肿瘤组织。 2. CD45+ TIL 的免疫磁性预富集 为了提高目标 TIL 细胞的频率及纯度，从肿瘤分离出来的单细胞悬浮液中， TIL
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