MeRIP-seq/测序 m6A/m5C | 核酸-蛋白互作

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MeRIP-seq (RNA甲基化测序）

m6A修饰

 

m6A的发生、发展

RNA上目前发现存在着100多种不同类型的转录后修饰，并且所有已知的RNA种类都可以被修饰，其中rRNA和tRNA的修饰最多。mRNA上的主要修饰类型包括m6A、m1A和m5C。其中m6A是最丰富的mRNA修饰，也是被研究的最清楚的RNA修饰。m6A修饰存在于mRNA、lincRNA、pri-miRNA和rRNA中。m6A修饰是一个可逆的过程，对m6A进行研究绕不开催化/擦除m6A修饰的修饰酶（Writers）/去修饰酶（Erasers)，以及各种阅读器蛋白（Readers），这些蛋白是m6A发生、发展，以及形式其调控功能的最重要的调控因素和效应分子：

Writers：

• METTL3–METTL14复合物是大部分mRNA、lncRNA和miRNA上的m6A修饰的催化酶；
• METTL16则催化负责SAM合成的特定mRNA，和U6 snRNA的甲基化；
• METTL5-TRMT112复合物负责催化18S rRNA的m6A甲基化；
• ZCCHC4负责催化28S rRNA的m6A甲基化；

Erasers：

• ALKBH5是主要的去甲基化酶；
• FTO可能主要负责m6Am的去甲基化；

Readers：

• YTH家族的五个成员，这些蛋白可以通过YTH结构域直接与mRNA上的m6A结合；
• IGF2BP，HNRNPA2B1和PRRC2A等，这些阅读器并不直接识别m6A修饰，而可能是与m6A的诱导的未折叠RNA结合；

 

 m6A的调控及其功能
 

m6A修饰目前发现在发育、增殖、分化、癌症发生等很多生物学过程中起着重要的调控作用。m6A修饰在mRNA的5'UTR和CDS的终止密码子附近富集，影响mRNA的稳定性，剪接和翻译，影响miRNA的加工成熟，并影响lincRNA的功能。这些不同的调控功能，重要是通过不同的效应蛋白结合行使的，如YTHDF2介导mRNA降解，而YTHDF1促进mRNA翻译。

meRIP-seq是参考Chip-seq发展出来的鉴定RNA修饰的一种方法，可以广泛应用于RNA修饰的研究，只要目标修饰存在商业化抗体，就可以针对该修饰进行meRIP-seq研究。目前meRIP-seq已成功应用于：

• m6A修饰（m6A-seq）
• m1A修饰（m1A-seq）
• m5C修饰（m5C-seq)

 meRIP-seq的实验原理如下图所示：首先通过polyA捕获mRNA，或者通过rRNA剔除去掉rRNA，然后将获得的RNA打成100nt左右的小片段；之后使用特定修饰特异的抗体（以m6A抗体为例）进行免疫共沉淀，含有m6A修饰的RNA片段被富集并回收；进而对回收的RNA进行文库构建、高通量测序和生物信息学分析，通过peak分析鉴定出m6A修饰的位点。

 

        由于rRNA中含有m6A修饰，因此实验过程中rRNA的剔除是必需的。目前存在两类技术去除rRNA的干扰，一种是polyA捕获正筛mRNA、另一种是rRNA剔除负筛rRNA，这两种方法成本上存在着巨大的差异，同时其检测对象和结果也显著不同：

 

• mRNA捕获：便宜，但仅能对mRNA和部分带有polyA尾的lncRNA上的m6A修饰进行研究，是目前最常用的方法；
• rRNA剔除：贵，且受物种限制，但该方法可以全面检测mRNA、lncRNA、circRNA和pre-mRNA上的m6A修饰，是非常全面的方法；

nano meRIP

 上述meRIP-seq可以解决大部分m6A修饰研究需求，但是上述方法对RNA的需求量比较大：

 

• 基于polyA捕获的meRIP/m6A-seq需要20 ug RNA；
• 基于rRNA剔除的meRIP/m6A-seq需要10 ug RNA；

 

        但是对于一些特殊样本，如少量原代细胞、珍贵的临床样本，则可能无法获得足量的RNA，因此无法通过上述meRIP-seq来对m6A修饰进行研究。为了解决这个问题，nano meRIP-seq问世了！ 

 

该技术应用了我公司应用在lncRNA-seq和互作转录组中的DSN rRNA剔除方法，实验流程如下：

 

• 首先将Total RNA进行片段化，至100 nt长度；
• 使用m6A抗体进行IP，并回收RNA；
• 将IP下来的RNA全部用于文库构建：由于rRNA上带有m6A修饰，因此该RNA中含有大量的rRNA，大幅提高了RNA量，使文库构建得以成功；
• 将构建好的文库，使用DSN消化高丰度的rRNA来源的DNA，从而富集mRNA、lncRNA和circRNA；
• 高通量测序和生物信息学分析

本技术可以针对低至500 ng的Total RNA进行meRIP-seq研究，同时还可以检测lncRNA、circRNA甚至是病毒RNA的的m6A修饰情况。


服务流程

您只需要提供足量的组织/细胞或RNA，我们将根据物种、RNA起始量为您推荐合适的meRIP实验方案~




产品优势

数百个项目经验！

UMI RNA-seq建库加成！

国内唯1的高通量、自动化meRIP工作站！
 

实测数据

我们已对数十个物种，提供了数百个项目的meRIP-seq，积累了丰富的项目经验。以下展示部分核心结果：

Peak在RNA上的分布

前期的研究表明，哺乳动物的m6A修饰在5‘UTR和stop codon处有富集，随着研究物种、组织类型越来越多，我们发现m6A修饰的特征远远超出我们之前的认识，从下图可以看到：

• stop codon处的富集在大多数物种、大多数组织类型中都是保守的；
• 5’UTR的富集并不明显；
• Start codon处在某些物种中存在显著富集；
• 部分RNA同时在start codon和stop codon处有富集；
• 部分RNA在CDS区有富集；
• 部分RNA在3‘ UTR存在显著富集；
• 同一物种的不同类型，其m6A修饰分布的情况差异很大；

Peak Reads在基因上的分布



 

• Peizhe Song, Junbo Yang, Chunling Wang, Qiang Lu, Linqing Shi, Subiding Tayier, Guifang Jia, Arabidopsis N6-methyladenosine reader CPSF30-L recognizes FUE signal to control polyadenylation site choice in liquid-like nuclear body, Molecular Plant, 2021. （IF：12.812）
• Hou Y ,  Sun J ,  Wu B , et al. CPSF30-L-mediated recognition of mRNA m6A modification controls alternative polyadenylation of nitrate signaling-related gene transcripts in Arabidopsis[J]. Molecular Plant, 2021, 14(4).（IF：12.812）