SY0583型线粒体膜通透性转换孔检测试剂盒(流式分析)优惠

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名称：SY0583型线粒体膜通透性转换孔检测试剂盒(流式分析)优惠
英文名：Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit ( flow cytometry)
规格：100T
产地：国产|进口
编号：SY0583
线粒体膜通透性转换孔，又称线粒体巨型通道（magachannel），是存在于线粒体内外膜之间的非选择性高导电性通道，由多种蛋白质复合组成。线粒体通透性转换孔 (mPTP)可能参与了细胞死亡过程中线粒体成分的释放。

正常的细胞线粒体内膜可维持正常的线粒体电位梯度以保证细胞呼吸作用及能量供应，随着Ca2+的摄入和释放，一种低电导渗透性转换孔在张开和闭合中来回切换。当细胞发生凋亡时和病理性死亡时，线粒体膜电位转换孔渗透性发生改变，Ca2+的过载，线粒体谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后继细胞色素C的释放，线粒体膜电位下降等都会导致线粒体渗透性转换孔的激活。

线粒体膜通透性转换孔检测试剂盒（流式分析）检测方法是一种相对于仅基于线粒体膜电位分析更直接的检测线粒体通透性转换孔开放的检测方法。其原理是：首先通过被动运输加载Calcein AM，后者是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，能够轻易穿透活细胞膜，被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子 Calcein，从而被滞留在细胞内，使胞质包括线粒体发出强绿色荧光。加入CoCl2后，来自胞质的荧光被CoCl2淬灭，仅留下线粒体内的荧光。作为对照，可将细胞加载Calcein AM和CoCl2的同时，对其用离子霉素处理，从而使细胞加载更多的Ca2+，引起线粒体通透性转换孔的激活从而使线粒体荧光淬灭。

本试剂盒以1ml标记体系计算，可供100次检测。检测最大激发波长494nm，最大发射波长517nm。

产品组份：
Calcein AM———————5×50µg
DMSO——————————250µl
CoCl2(80mM)——————1.2ml
Ionomycin(100µM)————750µl
Cell Stain Buffer———2×250ml

储存条件：-20℃避光干燥，避免反复冻融，有效期至少6个月

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·逆转录酶
编号：SY0293
英文名称：M-MLV (H-) Reverse Transcriptase
规格：5000U
本品适用于第一链cDNA合成，cDNA 片段长度最高可达12kb。也可用于低拷贝基因的检测。野生型的M-MuLV包含RNase H活性，该活性可催化降解DNA/RNA杂合体中的RNA，因而在cDNA 第一条链的合成过程中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA，本品为通过基因重组技术得到的点突变型RNase H活性缺失的逆转录酶，即M-MLV (H-) Reverse Transcriptase，与M-MuLV相比，不仅改善了模板RNA可能被降解情况，且具有更强的延伸能力和稳定性，可用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建。

注意事项

1）为保证反转录成功，建议使用高质量的RNA样品。
2）请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染。
3）如果RNA模板GC含量丰富或者具有复杂的二级结构，可以先只加RNA模板、引物和RNase free H2O混匀，65℃变性5min，冰上冷却，短暂离心后加入其他成分继续下面的反转录步骤。
4）为了您的健康，实验操作时请穿实验服和带一次性手套。

使用方法

1第一条链cDNA合成（以20μl反应体系为例）
1.1 按照表【1】配制反应体系

 

RNase free ddH2O	to 20μl
5×Reaction Buffer	4 μl
dNTP Mixture (10 mM each)	1 μl
Oligo(dT)18(0.5μg/μl)
or Random hexamer (0.1μg/μl)
or GSP(Gene Speicific Primer)(2 μM)	1 μl
RNase inhibitor (40 U/μl)	0.5 μl
M-MLV (H-) Reverse Transcriptase	1 μl
模板RNA	Total RNA: 50ng-5μg mRNA: 5-500ng
表1 cDNA第一条链合成反应体系表

1.2 轻轻混匀
若使用Oligo(dT)18或基因特异性引物，42℃孵育50min。
若使用Random hexamer，25℃孵育10min，42℃孵育50min。

1.3 65℃加热15min失活M-MLV (H-) Reverse Transcriptase。

2 RT-PCR
建议取1/10～1/5体积（2～4µl）的反转录产物作为PCR模板。
2.1 按照【表2】配制反应体系表
组分体积终浓度

cDNA模板	2μl	依需要调整
Forward Primer (10μM)	1μl	0.2 μM each
Reverse Primer (10μM)	1μl	0.2 μM each
10×Taq Buffer(含Mg2+)	5 μl	1×
2.5mM dNTPs	4μl	0.2 mM
Taq DNA Polymerase	0.5μl	2.5units
ddH2O to final volume	50μl	/
表2 RT-PCR反应体系表

2.2 按下列条件进行PCR反应：


储存条件：-20℃。


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