His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂库存

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名称：His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂库存
产地：国产|进口
品牌：百奥莱博
编号：SY0393
英文名：Ni-NTA Agarose Resin 6FF
规格：10ml
Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni2+）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。此外，因其基质的耐压性（可耐受最高0.3 MPa的压力），该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化，可在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化。

基质（Matrix）：高度交联的6%琼脂糖凝胶
孔径（Bead size）：45-165µm
载量（Capacity）：＞40mg 6×His-tagged protein/ml 基质
耐压（Tolerance Pressuremax）：0.3MPa, 3bar
储存缓冲液：含20%乙醇的1×PBS
储存条件：4℃保存，有效期2年

使用方法

（一）纯化流程
1 缓冲液的准备
缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22µm或0.45µm滤膜过滤除菌。可溶性组*酸标签蛋白纯化所需配方详见附表2。包涵体组*酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表3。

2 样品准备
2.1 细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达的蛋白纯化为例）
1）挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2）表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3）之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/ml。【注】：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
4）将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10µg/ml RNase A和5µg/ml DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
5）收集上述澄清蛋白液至离心管中，10000rpm，4℃离心20-30min。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶，5000rpm离心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、组*酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组*酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】：对于大量体积的上清，需加入硫*(代"酸")铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵体蛋白纯化（以细菌为例）
1）将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。
2）按照菌体：裂解液=1:10（w/v）的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。
3）将破碎液转移至离心管，10000rpm，4℃离心20-30min，去上清。可重复步骤2）和3）一次。
4）按照菌体：裂解液（含8M尿素）=1:10（w/v）的比例将包涵体充分悬浮。
5）变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

3 装柱
1）用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。
2）将树脂悬浮，小心地将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
3）如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
4）打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如达不到推荐的压力或流速，可以用所用泵的最大流速，这样也可以达到一个较好的装填效果。当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱体积的去离子水。标上柱床高度。【注】：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%。
5）关闭泵，关闭层析柱出口。
6）如使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。
7）将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
8）将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如需要可重新调整分配器。

4 样品纯化
装柱后，可用各种常规的中压色谱系统，以AKTA使用为例进行说明：
1）将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞，连接至色谱系统中，打开下出口，将纯化柱连接到色谱系统中，注意旋紧。
2）3-5倍柱体积去离子水冲洗纯化柱。
3）至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。1ml规格预装柱推荐流速为1ml/min，5ml预装柱推荐流速为5ml/min。
4）利用泵或注射器上样，收集流出液，以便SDS-PAGE检测蛋白结合情况。【注】：若样品粘度增加，即使上样体积很少也会导致层析柱很大反压；上样量不要超过柱子的结合能力；大量样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
5）Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。
【注】：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6）Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。
7）建议用更高浓度咪唑（如500mM）彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

5 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

（二）在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa）或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗时，先把Ni2+脱掉，清洗结束后，将填料保存在20%乙醇中，后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液，接触时间为1-2h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。

2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

（三）填料再生
当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa），填料上面出现明显的污染，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。按照下面操作流程进行：
1）使用0.2M 醋酸溶液（含6M GuHCl）清洗2倍柱体积；
2）去离子水清洗5倍柱体积；
3）2%SDS清洗3倍柱体积；
4）去离子水清洗5倍柱体积；
5）乙醇清洗5倍柱体积；
6）去离子水清洗5倍柱体积；
7）100mM EDTA（pH 8.0）清洗5倍柱体积；
8）去离子水清洗5倍柱体积；
9）100mM NiSO4清洗5倍柱体积；
10）去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。

除His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂库存外，我公司正在打折促销以下产品：
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·5×非变性蛋白上样缓冲液
编号：SY0350
规格：2ml
本品用于常规的非变性聚丙*(代"烯")酰胺（PAGE）蛋白电泳样品上样。5×非变性蛋白上样缓冲液(Non-denatured Gel Sample Loading Buffer)是一种经过改良的以*酚蓝为染料，5倍浓缩的蛋白上样缓冲液。产品中不含有SDS等变性试剂，但是含有还原性试剂DTT。


注意事项
1)为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2)5×非变性蛋白上样缓冲液中含少量DTT，有轻微刺激性气味，但不含剧毒的巯基乙醇。

操作方法
1.在室温或不超过37℃的水浴中溶解5×非变性蛋白上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放，尽量避免长时间置于水浴中。
2.按照每4 μl蛋白样品加入1 μl 5×非变性蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和5×非变性蛋白上样缓冲液。
3.直接上样到PAGE胶加样孔内即可。
4.通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

储存条件：-20℃，有效期一年。

·Cy3标记兔抗绵羊IgG(H+L)
编号：SY0717
英文名称：Cy3-AffiniPure Rabbit Anti-Sheep IgG (H+L)
规格：100μl
本品是由Cy3标记的兔抗绵羊IgG（H+L），使用抗原偶联的琼脂糖微珠从兔抗血清内亲和色谱纯化所得。免疫电泳和/或ELISA法检测显示本品特异性结合完整的绵羊IgG分子，也会与其他绵羊免疫球蛋白的轻链结合。可能会与其他物种免疫球蛋白发生交叉反应，但不会识别非免疫球蛋白类的血清蛋白。

Cy3最大激发波长（Amax）为550nm，最大发射波长（Emax）为570nm。本品适合做单标实验，广泛应用于多种免疫学实验如免疫细胞化学（ICC），流式细胞术（FC）以及免疫组化（IHC）等。要做多标（multiple-labeling）实验，建议使用与相近物种血清蛋白或者免疫球蛋白预先经过亲和吸附处理的二抗。

浓度：0.75mg/ml
缓冲液：0.005M 磷酸*，0.125M *化*, pH 7.6
稳定剂：7.5mg/ml BSA（无IgG，蛋白酶），50% 甘油
防腐剂：0.025% 叠氮化*
推荐稀释比例：1:50～400（适合多数实验）
储存条件：-20℃，避免反复冻融，有效期一年。


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·耐热逆转录酶II
编号：SY0294
英文名称：Reverse Transcriptase II
规格：2000U
Reverse Transcriptase（第二代耐热逆转录酶）是Reverse Transcriptase（第一代耐热逆转录）的升级产品，是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上通过体外分子进化技术获得的全新耐热逆转录酶。与上一代相比，进一步大幅提高了热稳定性，50℃下半衰期超过240min，并长时间耐受55℃高温且保持稳定，非常适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。此外，增加了多个突变位点，进一步增强了模板亲和力和行进性，大幅提升全长cDNA的合成能力，可获得长达20 kb的cDNA。另外，对于常见的逆转录抑制物具有更高的耐受度，非常适合于植物组织RNA的逆转录反应。

活性定义：以Poly(rA) Oligo(dT)为模板/引物，在37℃，10min内，掺入1 nmol的dTTP为酸不性溶物质所需要酶量定义为1个活性单位（U）。

质量控制
核酸外切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在37 ºC下孵育1h，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在37 ºC下孵育1h，DNA的电泳谱带不发生变化。
RNase残留检测：200 U本品和1 μg小鼠肝脏总RNA在37 ºC下孵育1h，RNA电泳谱带不发生变化。
功能检测1：逆转录体系中加入200 U本品，以100 pg Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)23为引物，50 ºC反应30min。取10% cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550 bp条带。
功能检测2：逆转录体系中加入200 U本品，以500 ng Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)23为引物，55 ºC反应45min。取10% cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的4.8 kb (GC-rich)条带。
功能检测3：逆转录体系中加入200 U本品，以1 pg-1 μg Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)23VN和Random Hexamers为引物，测试qRT-PCR 性能。以6个数量级的模板量的对数值对Ct值做标准曲线，R2>0.990，斜率在-3.20到-3.60之间。

准备工作
1. 防止RNase污染：请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase free。
2. 引物选择：
2.1 后续实验为PCR
a, 如果模板为真核生物来源，一般情况下首选Oligo dT18，与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
b, 基因特异性引物 (GSP)的特异性最高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成。这时，可改用Oligo dT18或Random hexamers重新进行逆转录。
c, Random hexamers特异性最低，所有RNA，包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo dT18或基因特异性引物 (GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random hexamers为引物。
2.2 后续实验为qPCR
a, 将Oligo dT18与Random hexamers混合使用，可使mRNA的各个区域均能以相同效率引发cDNA合成，有助于提高定量结果的重复性。

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