TGIRT-III Reverse Transcriptas

TGIRT-III RTnase具有依赖于DNA/RNA杂交链的反转录酶活性，能快速合成cDNA，该酶具有强的链转换活性（Switch）。因此该酶可用于tRNA、ncRNA、miRNA等核酸分子的同步逆转录和加接头（TGIRT template-switching reaction，用于TGIRT-Seq）。TGIRT-III RTnase具有极强的延伸性能，因此更易获得全长的cDNA。除此外，该酶具有的强switch活性，使得可以利用RNA的5’端帽结构进行SMART建库（SAMRT-Seq）。该酶的反应温度为37-60°C，最佳反应温度为50°C。
主要特征
比逆转录病毒逆转录酶更高的热稳定性，持续性和保真度，允许从高度结构化或严格修饰的RNA进行全长的端到端cDNA合成。
新的端对端模板转换活性，其能够在逆转录过程中连接RNA-seq或PCR接头，并且不再需要单独的RNA 3'-接头连接步骤
不需要RNA连接酶，对模板量要求低，使得RNA-seq文库构建步骤简化从而更高效。
组分
名 称 500 pmol
TGIRT-III RTnase (10 pmol/μl) 50 μl
5×TGIRT Buffer 0.5 ml
100mM DTT 100 μl
10XDuplex Buffer 0.5 ml
储存：-20°C 可保存 2 年。
应用
链特异性转录组分析
全细胞或无细胞转录组测序
非编码RNA转录组测序
RIP-seq, HITS-CLIP, irCLIP and CRAC
通过高通量测序鉴定RNA碱基修饰
RNA结构映射
长cDNA的合成
全基因组或靶向RNA结构分析
失活
反应结束后，向反应体系中加入1μl的5N NaOH，并置于95°C下加热3min，失活该酶。失活后加入5N HCl中和高碱性条件。
储存
长期储存置于-20°C以下，可保存2年；短期使用置于4°C（3个月）保存。
使用方法
1.典型的TGIRI-Seq反应：
5×TGIRT Buffer                                       4 μl
100mM DTT                                            2 μl
RNA                                                  1~50ng
1μM of Annealed DNA/RNA duplex        2 μl
TGIRT-III RTnase (10 pmol/μl)                1 μl
RNase Free H2O                       up to 17.5 μl
室温孵育30min后，加入2.5 μl的10mM dNTP后，于37-60°C（推荐温度为50°C）条件下反应5-60min（通常15min）。