BCA法蛋白定量试剂盒

本产品是基于 BCA 法（bicinchoninic acid，二奎啉甲酸法）蛋白检测原理开发的蛋白质浓度测定产品，BCA 法跟 Lowry 法的第一步完全相同，就是在碱性条件下，蓝色的 Cu2+被蛋白质还原成紫色的 Cu+。此反应类似 Cu2+与 Biuret（NH2-CO-NH-CO-NH2，双缩尿）发生的反应，故又叫 Biuret 反应（Biuret反应本省就可以测定蛋白质浓度，目前仍然是医院血液蛋白定量的方法）
第二步，Cu+与 BCA 发生反应形成水溶性的紫色化合物，通过分光在 562 nm 处测定紫色化合物的量就可以精确定量蛋白质浓度。BCA 检测灵敏度比 Biuret 反应高 100 倍左右。
BCA法蛋白定量试剂盒产品特点

此方法的特点如下。
1. 对各种常见的去污剂不敏感，但对 Cu 的还原剂和螯合剂比较敏感。
2. 比 Lowry 法更加简单快捷，45 分钟内完成测定。
3. 试剂稳定，室温可以放置两年。工作液 1 天内有效。
4. 线性范围在 20～2000 µg/mL。如果需要范围在 0.1-10ug/mL，需要选用超敏 BCA。
5. 最小测量体积为 1-20 uL。
6. 终产物稳定，变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。
7. 可以检测最短到双肽，而 Bradford 法需要一定大小的蛋白质。
8. 有常规（试管）和微量（96 孔板）两种检测模式。
BCA法蛋白定量试剂盒使用方法 一：96 板操作模式
1、 取一块 96 孔板，先进行编号（编号可以根据样品数增加），并按照下表加入BSA 标准，待测样品和溶解待测样品的缓冲液(可以用水替代)：
2、 计算 BCA 工作液需要量：根据样品数量（包括制备标准曲线的样品的数量）和每个样品需要 0.2 mL BCA 工作液的比例，计算所需 BCA 工作液的用量，然后加上 10%损耗作为实际需要配制的量。例如：计算出需要 5mL 工作液，实际按不少于 5.5 mL 的量配制。
3、 配制 BCA 工作液：按 50 体积溶液 A 加 1 体积溶液 B（50:1）的比例将二者充分混合，所得溶液即 BCA 工作液。比如：5 ml 溶液 A + 100 µl 溶液B。
注意：取用溶液 A 和溶液 B 前需要充分摇匀，溶液 B 非常容易形成沉淀，需要 65℃加热溶解后才能使用。当把溶液 B 刚加入到溶液 A 中时，最初会出现淡绿色沉淀，轻微晃动沉淀即会消失，工作液最后成绿色，可以室温放置 12 天，但需要将容器的盖子拧紧。
4、 将 10 倍体积（20μL 的 10 倍体积即 0.2 mL）的 BCA 工作液加入到各孔中并混匀。也可把 96 孔板放在振荡器上振荡 30 秒混匀。
5、 37℃放置 30 分钟。
6、 冷至室温，10 分钟内完成后续测定，否则化学反应还在继续进行，使光吸收值慢慢升高，每 10 分钟会升高 2.5%左右。
7、 在 562 nm 下比色测定样品的光吸收。如酶标仪没有 562 nm 的设定，可用接近的波长检测，如 570 nm。
8、 将编号为 0 号的样品（对照）的读数从其余所有样品（包括 0 号样品，其读数变成零）中扣除。
9、 以 0-7 号样品的 BSA 含量（μg，见上表最右行）为横坐标，以样品的吸光值为纵坐标，绘出 BSA 的标准曲线。
10、再将待测样品的吸光值（减去 0 号样品的读数后的值）标在标准曲线上，其在横坐标上对应的蛋白含量（μg）就是待测样品中的蛋白质含量，除以样品稀释液总体积（20 μL），乘以样品稀释倍数即为样品浓度（μg/μL）。
二：试管测定模式
1、 基本操作同上，只是操作改在编号的玻璃试管中进行，同时 BSA 标准品（2ug/uL）的使用量从低到高改为 0、5、10、20、40、60、80、100uL，样品的总体积从 20uL 改为 100uL，BCA 工作液的用量从每个样品 0.2 mL改为 2 mL。
三：BCA法蛋白定量试剂盒注意事项
1、 BCA 法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。所以，如果蛋白质浓度较低，可以改在 60℃孵育 30分钟或更长。
2、 待测样品浓度在 20～2000 微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。
3、 在一定浓度范围内 BCA 法测定蛋白浓度不受下列化学物质的影响：
4、 本方法受样品中螯合剂和还原剂的影响，所以需确保 EDTA 浓度不高于10mM，二硫苏糖醇不高于 1mM，β-巯基乙醇不高于 1mM，没有任何EGTA，否则建议使用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒（CAT#:80815）。
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