Pfu DNA Polymerase哪里买

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博专注于生命科学和生物技术领域，致力于为客户提供包括Pfu DNA Polymerase哪里买在内的一系列分子生物学试剂产品，并提供一系列相关的技术服务。

名称：Pfu DNA Polymerase哪里买
编号：WE0107
规格：500U
产地：国产|进口
英文名：Pfu DNA Polymerase
品牌：百奥莱博
  Pfu DNA Polymerase是通过大肠杆菌表达纯化的重组酶，具有5"-3"DNA聚合酶活性和5"-3"外切核酸酶活性的同时具有3"-5"外切核酸酶活性，因此在DNA扩增过程中具有纠错能力，是目前发现的错配率最低的耐高温DNA Polymerase。该酶与Taq DNA Polymerase相比具有更好的热稳定性，对于高GC含量模板，提高变性温度对它活性无影响。使用本产品扩增得到的PCR产物的3"端不带有“A”碱基，不能直接用于T/A克隆，如需进行T/A克隆则需要在其末端添加“A”或用平末端载体进行克隆。本产品适用于基因克隆、基因定点突变、SNP和末端补平等实验。

产品组成：

 

组份	500U
Pfu DNA Polymerase, 5 U/μl	100μl
10×PCR Buffer	1.8ml

注意：本产品的10×PCR Buffer中含有15 mM*离子。

活性定义：
用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃，30分钟内，将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸性不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位(U)。

质量控制：
1、经过多次柱纯化，SDS-PAGE检测其纯度大于99%；
2、经检测无外源核酸酶活性；
3、PCR方法检测无宿主残余DNA；
4、能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因；
5、室温存放一个月，无明显活性改变。

使用方法：
以下举例为以人基因组DNA为模板，扩增1 kb的片段的PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
10×PCR Buffer	5μl	1×
dNTP Mix，10 mM each	1μl	200μM each
Forward Primer，10μM	2μl	0.4μM
Reverse Primer，10μM	2μl	0.4μM
Template DNA	<0.5μg	<0.5μg/50μl
Pfu DNA Polymerase, 5 U/μl	0.5μl	2.5 U/50μl
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)用Pfu酶扩增时，引物的纯度要求较高，引物长度大于18个碱基，引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
2)Pfu酶3"-5"外切酶活性可能降解引物，所以应先加dNTP后，再加Pfu酶到反应体系中，并立即进行PCR反应。

2、PCR反应条件

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	2 min
变性	94℃	30 s	25-35 个循环
退火	55-65℃	30 s
延伸	72℃	60 s
终延伸	72℃	5 min

注意：
1)Pfu酶的热稳定性比Taq酶好，对于GC含量很高的模板，变性温度可以提高到98℃，对Pfu酶的活性无影响。
2)一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
3)Pfu酶具有3"-5"外切酶活性，所以Pfu酶扩增时延伸速度远比Taq酶低，延伸时间根据所扩增片段大小设定，本产品的扩增延伸速率为1 kb/min。
4)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。
5)本产品具有3"-5"外切核酸酶活性，PCR产物3’端不带“A”,不能直接用于T/A克隆，如需进行T/A克隆则需要在其末端添加“A”或用平末端载体进行克隆。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。

关于Pfu DNA Polymerase哪里买的更详细说明，请致电我公司咨询，我们将以最饱满的热情为您提供解答，此外，我公司专业供应下列产品：

·结核分枝杆菌基因分型试剂盒(VNTR-9)
编号：WE0118
英文名称：TB Typing Kit(VNTR-9)
规格：50次
  本试剂盒是以分子流行病学最新研究进展为基础，经工艺优化后形成的人型结核分枝杆菌基因分型产品。本产品利用结核分枝杆菌基因组中可变数目串联重复序列(variable-number tandem repeats, VNTR)多态性进行基因型分型区分临床菌株，是研究结核分枝杆菌分子流行病学和监测结核病传播状况的有力工具。与现有其它基于VNTR原理的结核分枝杆菌VNTR分型系统相比，这一分型系统对中国流行的菌株具有更强的分辨能力，因此特别适合于中国用户的需求。

  通过对各PCR反应引物序列和预混反应液成份进行精心优化，使得本产品具有很强的抗干扰力。与用户自配试剂相比，本产品显著提升了特异条带信号强度，降低了使用粗制模板(煮沸菌液)时非特异条带的出现率，使实验操作更加简便、快捷的同时，提高了检测成功率。本产品的预混反应液化学稳定性良好，能有效抵抗反复冻融(10次)和较长时间(一周)的室温环境，更好地适应了用户检测工作中的灵活性需求。

  本产品将人型结核分枝杆菌(MTBC)鉴定、非结核分枝杆菌(MOTT)及模板质量鉴定、结核分枝杆菌北京家族菌株鉴定，和后续的9位点VNTR分型鉴定整合在一个试剂盒中，使用户仅需一个试剂盒、12个PCR反应即可获得待测菌株基因型鉴定所需的完整信息。检测的分辨力指数(Hunter-Gaston index，HGI)可达0.989 。并且，基因型鉴定结果可数字化记录，使得不同样本批次，不同地区，不同时间，不同研究者之间的实验数据可以很方便地进行比对和汇集分析，极大地提高了数据的使用效率。

  对鉴定为VNTR-9基因型成簇(所有9个位点具有相同重复数)的样本，若要判定菌株间是否存在近期传播关系，需使用配套产品TB基因分型试剂盒HV-3(货号WE0119)，做进一步的分型鉴定。VNTR-9与HV-3两个产品的结合使用可将检测的HGI提升至0.993 。关于TB基因分型试剂盒HV-3(货号WE0119)产品的更多信息请见其产品说明书。


Pfu DNA Polymerase哪里买关键词：Pfu DNA Polymerase,WE0107


·His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)
编号：WE0267
英文名称：His-Tagged Protein Purification Kit(Soluble Protein)
规格：5ml
  本试剂盒包含Ni-Agarose填料、亲和柱空柱以及可溶性His融合蛋白纯化所需的全部试剂(细菌裂解液、蛋白酶抑制剂混合物、结合缓冲液和洗脱缓冲液组分)，使用方便。该镍柱纯化系统对6×His-tag蛋白具有显著特异吸附能力，能够高效一步纯化带有6个组*酸亲和标签的蛋白。该系统具有4个Ni2+螯合位点，较只有3个螯合位点的Ni-IDA结合Ni2+更为牢固，有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。较高的基团密度，大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统(如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌)中的His标签蛋白，均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子，可直接用可溶性蛋白的纯化，使用方便，快捷。

镍柱参数：
支持物：CL-6B琼脂糖凝胶
载量：20-30 mg His标签蛋白/ml填料
粒径：50-160μM

试剂盒组成：

组份	5ml
Ni-Agarose Resin	5ml
Bacterial Protein Extraction Reagent	65ml
1 M Tris-HCl(pH7.9)	15ml
1 M Imidazole	65ml
3 M NaCl	120ml
Protease Inhibitor Cocktail	700μl
吸附柱(12ml)	一套

保存条件：Protease Inhibitor Cocktail，-20℃；Ni-Agarose Resin，2～8℃，避免冷冻；其它组分，2～8℃

注意事项：
1、在纯化之前采用电泳检测蛋白的可溶性，本试剂盒只适合于可溶性蛋白的纯化，如需纯化包涵体蛋白，请选择我公司的包涵体蛋白纯化试剂盒，货号为WE0266。
2、缓冲液中不建议使用 β-巯基乙醇、DTT和EDTA。
3、整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
4、为提高纯化效率，首先确定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的最佳使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的咪唑浓度，Binding Buffer的范围为0-10 mM，洗脱缓冲液的范围为10-500 mM来进行。并通过SDS-PAGE或Western Blotting来检测目的蛋白的纯度。
5、请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.22μM或者0.45μM过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用0.22μM或者0.45μM过滤器过滤。
6、柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。

使用方法：

I 缓冲液的准备
可溶性蛋白纯化缓冲液配方：


 

组份	Tris-HCl(pH7.9)	Imidazole	NaCl
Soluble Binding Buffer	20 mM	10 mM	0.5 M
Soluble Elution Buffer	20 mM	500 mM	0.5 M

II 组装层析柱
1、将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。
注意：
1)填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每ml填料纯化20-30mg His标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。
2)如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。
3)本实验都是通过重力作用使溶液流出。
2、向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。
注意：柱体积指的是填料的体积。

III 可溶性蛋白的纯化
1、收集菌体后，每100 mg菌体(湿重)加入1-5ml细菌裂解液(每1ml 细菌抽提试剂中已加入10μl 蛋白酶抑制剂混合物)，超声裂解菌体。
注意：
1)当提取物粘度高或提取蛋白为包涵体时，建议加入DNase I和Lysozyme。每1ml 细菌抽提试剂中加入1μl DNase I(1000U/ml)，2μl Lysozyme(50 mg/ml)，DNase I和Lysozyme可单独从我公司购买，货号：Lysozyme(#WE0214)、 DNase I(#WE0213A)，如使用其它公司产品，请按照相应说明书操作。
2)超声过程中保持菌液处于冰浴中，超声条件依赖于所使用的超声仪功率，探头种类，容器的大小形状，需实验中自己摸索，应避免连续超声导致的大量产热，可分成短时间，多次超声，通过一定的间隔时间避免溶液过热。最终菌液变清即可。
2、10000 rpm,4℃离心3分钟，收集上清中的可溶性蛋白。
3、用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。
注意：
1)本试剂盒中附带有一块筛板，使用时先将筛板加至填料的上层，该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤，防止过多的杂蛋白堵塞柱子的作用。再将处理好的样品负载上柱，但是筛板放入柱子后就不易取出。
2)通过控制加入的菌体裂解液的速度来控制流速。
4、使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。
5、使用适量Soluble Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
注意：洗脱峰可以分管收集，每1ml收集1管，并采用蛋白监测仪监测，收集洗脱峰。
6、洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，封柱后2～8℃保存。
注意：如果是分段梯度洗脱，最大洗脱缓冲液中咪唑浓度未达到500 mM时，则使用浓度为500 mM的咪唑进行洗脱10倍柱体积后，再进行第6步的操作。

Ⅳ 柱再生
当填料使用多次后，结合效率会有所下降(表现为流速变慢或填料失去蓝绿色)，可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。
1、使用2倍柱体积的6 M盐*(代"酸")胍冲洗后，使用3倍柱体积的去离子水冲洗。
2、使用1倍柱体积的2% SDS冲洗。
3、依次使用1倍柱体积的25%、50%、75%和5倍柱体积的100%乙醇冲洗，再依次使用1倍柱体积的75%、50%和25%的乙醇冲洗。
4、使用1倍柱体积的去离子水冲洗。
5、使用5倍柱体积含50 mM EDTA缓冲液(PH8.0)冲洗。
6、使用3倍柱体积去离子水，3倍柱体积20%乙醇冲洗。
7、2～8℃保存。
8、再次使用前，需首先使用10倍柱体积去离子水冲洗，然后使用5个柱体积的50 mM NiSO4再生，3个柱体积的Binding Buffer平衡。

储存条件：-20℃


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