动植物膜蛋白微量制备试剂盒现货

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

百奥莱博专业生产供应动植物膜蛋白微量制备试剂盒现货，我公司销*(代"售")全品类的分子生物学试剂，价格优惠，欢迎广大科研工作者垂询订购。

名称：动植物膜蛋白微量制备试剂盒现货
编号：BTN91204
规格：50次
产地：国产|进口
品牌：百奥莱博
细胞膜蛋白质参与了很多重要的细胞活动，根据它们与膜结合的位置一般分为两种，一种是附着在细胞膜上，另一类是嵌入到细胞膜中间。附着型膜蛋白疏水性较弱，比较容易提取和纯化；而嵌入型膜蛋白疏水型很强，所以在水溶液里面很难溶解，非常难以提取和纯化。百奥莱博根据上述特点，经过精心优化的、开发出本产品，专门用于分离纯化这两种膜蛋白。

产品特点：
1. 两步法提取，先纯化含膜组分，再分离附着型膜蛋白和嵌合型膜蛋白。
2. 膜蛋白(附着型+嵌入型)产量高，对肝脏组织而言，其线粒体膜蛋白产率为10μg/mg左右，过氧化物酶体为1μg/mg左右，内质网为25-30μg/mg。
3. 所得的膜蛋白大部分具有生物活性，可用于活性研究。
4.可用动物、植物培养细胞和实体细胞为材料，也可用预先纯化的含膜组分或细胞器(如线粒体、叶绿体、内质网、过氧化物酶体)为材料(本试剂盒不含纯化细胞器的试剂)。
5. 本方法重复性好。
6. 本试剂盒足够50次微量提取，分A型和B型两种。A型用于附着型膜蛋白，B型用于嵌合型膜蛋白和附着型膜蛋白。

试剂盒组成：

 

成分	A型	B型
溶液A	100ml	100ml
溶液B	10ml	10ml
溶液C	50ml	100ml
说明书	1份	1份

储存条件：常温运输及保存，有效期一年。

使用方法：
1. 对培养细胞：收集1×107个培养细胞(动物细胞、植物细胞)，用20mL自备的冰浴的PBS 洗涤三次，每次洗涤后需要4℃下1000 g离心2分钟，然后小心弃上清。对实体组织：由于各种动植物的各种实体组织的属性差别太大，故本手册的纯化膜组分的操作步骤(第1-7 步)不一定完全适合，用户需要自行优化以纯化含膜组分或含膜的细胞器(如细胞质膜、内质网、线粒体、叶绿体等)，再将含膜组分或细胞器沉淀直接用于第8 步的膜蛋白提取。
2. 将洗涤后的细胞沉淀重悬在2mL溶液A中，冰上静置10分钟。注意：膜蛋白有膜的保护，在纯化过程中对蛋白酶的降解没有胞浆蛋白敏感，一般可以不加蛋白酶抑制剂。但如果纯化的膜蛋白的确有降解的话，可以在溶液A中加入自备的蛋白酶抑制剂混合物。
3.转移到容积为2mL的Dounce 玻璃匀浆器上下匀浆20-50次(具体次数取决于细胞种类，293T细胞一般需要20次左右，而MEF细胞一般需要50次左右。最好用样品先进行预实验以摸索最佳匀浆次数，最佳匀浆次数时在显微镜下能看见细胞破裂但细胞核完整)。
4. 将匀浆液转移到15或50mL塑料管中，加入相当于匀浆液体积1/10的溶液B，其间可以轻柔颠倒混匀3-5次，留少量样品作为对照1(匀浆液)。
5. 4℃ 2500rpm离心20分钟，沉淀为细胞核，上清为胞浆和膜成分，留少量样品作为对照2(胞浆和膜成分)。
6. 将上清液用Beckman Optima 台式超速离心机100,000 g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该为100,000g，否则有可能得不到膜成分沉淀。
7.小心转移上清(胞浆部分)并留少量样品作为对照3(胞浆)。
8. 将沉淀(含膜组分)重悬于1mL 冰浴的溶液C中后，冰上静置30分钟，留少量样品作为对照4(膜成分)。本成分电泳前，需要先用自备的TCA沉淀(TCA 终浓度为10%)，再用冰冷的丙*(代"酮")洗涤两次后再溶解在1×上样液中待用。对照1-3 号不需要这样的预处理。
9. 用Beckman Optima 台式超速离心机100,000g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。
10. 如果需要附着型膜蛋白，则取上清(含附着型膜蛋白)弃沉淀(含膜和其中的嵌合型膜蛋白)。上清可以放-20℃长期保存，如果需要电泳，需要先用自备的TCA沉淀(TCA 终浓度为10%)，再用冰冷的丙*(代"酮")洗涤两次后再溶解在1×上样液中与对照1-4 号一起上样电泳。
11. 如果需要嵌合型膜蛋白，则取出上清(含附着型膜蛋白)并留少量样品作为附着型膜蛋白样品，然后再用1mL 冰浴的溶液C重悬沉淀，然后100,000g 4℃离心60分钟，去掉上清(上清含残留的附着型膜蛋白，可以留样作为洗涤后的附着型膜蛋白样品)。沉淀含膜和其中的嵌合型膜蛋白。如果需要测定膜蛋白的浓度，则将其溶解在自备的0.5 M NaOH溶液。

更多有关动植物膜蛋白微量制备试剂盒现货的价格及使用说明等，请联*(代"系")我们的业务经理王欣女士咨询，我公司还销*(代"售")以下产品：

·一管式点突变试剂盒
编号：BTN100212
英文名称：One-Tube Mutagenesis Kit
规格：10次
基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。但传统的方法需要使用单链DNA 模板，而得到单链DNA 模板又需要先将基因克隆到类似M13 这种载体中，操作过程冗长。为了克服这些缺点，本公司将突变位点设计到一对互补的引物中，用高保真扩增质粒模板，然后用Dpn I 去除原始的甲基化模板，新合成的DNA 通过互补形成带切口的双链质粒，直接用于转化感受态细菌。

产品特点：
1. 直接使用质粒DNA作为模板，免去了制备单链DNA的步骤。
2.基于高保真PCR，对模板DNA 序列没特殊要求，可以用于突变任何序列。同时对模板的需求量很少。
3.一管式，全部在一个优化的缓冲体系中完成，非常简单。
4. 使用Dpn I 去除未突变模板，突变效率高达90%。
5.可用于制备点突变，缺失突变和插入突变。
6. 本产品A型适用于8 kb以下，B型适用于8-15 kb。

试剂盒组成：

成分	10T(A型)	10T(B型)
高保真酶A型	10μl	无
高保真酶B型	无	10μl
5×高保真酶Buffer A型	100μl	无
5×高保真酶Buffer B型	无	100μl
dNTP(2.5mM each)	50μl	50μl
Dpn I酶	10μl	10μl
超纯水	1ml	1ml

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、引物设计及注意事项
用于特定基因突变的引物必须用户单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计。
1. 共需设计两条完全互补的一对引物，它们覆盖要扩增的突变区位点，突变位点最好放在引物的中心。可以先集中设计一条，然后就可得互补的另一条引物。
2.引物的长度通常为25-45个碱基。引物中突变位点任何一侧都必需满足Tm大于45的条件，Tm 计算方式为Tm=4×(GC 碱基数)＋2×(AT 碱基数)。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就达到此标准，它的突变位点AAG 所放位置使左侧Tm＝46；右侧Tm＝48，均大于45。
3. 尽量把引物的GC含量控制在40％-60％，结尾的1-3个碱基最好是G或C。
4. 尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。
5. 最好使用经过PAGE 纯化的引物或更高纯度的引物。

二、待突变模板质粒的选择
1. 必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变，否则Dpn I 不能把没有酶切的质粒DNA 切除，产生大量的假阳性。常用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。不能使用JM110和SCS110以及其它dcm-菌种。
2. 待突变质粒和目的基因的GC含量应该在40-55％，没有任何GC含量超过70%、长度在50bp以上的区域。如果质粒GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果突变位点在高GC 区，则可以使用高GC 专用PCR反应试剂。

三、基因定点突变反应
1.在一个塑料离心管中加入下列成分：

待突变模板质粒	0.1-0.5μg
5×高保真酶Buffer	10μl
引物一(10-20 uM)	1μl
引物二(10-20 uM)	1μl
dNTP Mix(2.5mM each)	4μl
补水到	49μl

2. 加入1μl高保真DNA聚合酶，混匀，如果PCR仪没有热盖则需要加少量石蜡油。放入PCR仪器中按下面参数进行PCR：

步骤	温度	时间	循环数
变性	95℃	1min	1次
PCR	95℃	40s	18次
	60℃	1min
	68℃	1min/Kb
延伸	72℃	10min	1次
保存	4℃	长时间保持

四、Dpn I消化
PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1μL Dpn I内切酶(该酶在甘油保存液中会下沉到管底，故用前需要充分混匀)。DpnI可以酶切双链都被甲基化的模板质粒，也能降解一条链被甲基化的双链质粒。混匀后37℃孵育2小时后样品可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。

五、转化、挑克隆鉴定：
每100 微升感受态细菌(转化效率必须在107/μg以上)中可以加入5-10微升经过Dpn I 消化后的突变产物，按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作。如果PCR 使用了石蜡油，在转化时千万别把它带入转化反应，否则会严重影响转化效率。
在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌全部涂布到含有适当抗生素的平板上培养过夜。通常会得到50个以下的克隆，可按常规方法制备质粒并测序。

六、常见问题：
1.转化后没有克隆或克隆数极少：
(1)感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在107/μg。
(2)把Dpn I 消化后的产物用常规的乙醇沉淀浓缩，这样就可以把所有的产物全部用于转化。
(3)优化基因定点突变中的PCR参数。可以把最初的95℃变性时间延长为2分钟，循环中95℃变性的时间延长至1分钟，把循环中的68℃的延伸时间改为1.5分钟/kb 至2分钟/kb，退火可以改为60-55℃或65-55℃等的touch down，退火时间也可以适当延长。
(4)引物设计有问题。通过突变反应中的PCR 没有很好地扩增出预期的突变质粒。
2.有克隆，但没有或很难检测到预期的突变克隆：
使用的待突变的模板质粒量过多，导致Dpn I 消化时不完全，可减少质粒用量。
3. 有突变克隆，但突变位点不是预期的位点：
(1)引物设计不佳，退火温度过低，导致引物退火到错误的地方。
(2)引物质量较差，没有经过PAGE 纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物，容易导致非预期的突变。


动植物膜蛋白微量制备试剂盒现货关键词：Animal-Plant Membrane Protein Miniprep Kit,BTN91204,动植物膜蛋白微量制备试剂盒


·CpG甲基转移酶(M.SssI)
编号：BTN120511
英文名称：CpG Methyltransferase(M.SssI)
规格：100U
CpG甲基转移酶(M.Sssl)能识别双链DNA上的二核苷酸序列并甲基化其中的所有胞嘧啶残基(C5)，其甲基化过程如下图所示：


产品用途：
1．阻止限制性内切酶的切割。
2．CpG甲基化依赖性基因表达的研究。
3．研究特异序列与DNA大沟的相互作用。
4．改变DNA的物理特性。
5．对DNA统一进行［3H］ 标记。
6．减少限制性内切酶的酶切位点数目，提高限制性内切酶的特异性。

备注
1．CpG甲基转移酶(M.Sssl)可以特异性地模拟高等真核生物基因组的修饰模式，因而可用于研究高等级真核生物体内胞嘧啶甲基化的功能。与哺乳动物甲基转移酶不同，CpG甲基转移酶对未甲基化和半甲基化的DNA底物的甲基化效率相同，因此该酶是更为有效的DNA修饰工具。
2．只要限制性内切酶的识别位点含有CG序列或此二核苷酸的重叠序列，CpG甲基转移酶均能有效地阻止其发挥切割活性。需要注意的是，CpG甲基转移酶使DNA甲基化，而E.coli中的Mcr和Mrr的限制作用不受甲基化影响，故应使用Mcr-、Mrr-的E.coli菌株作为转化的宿主菌。
3．胞嘧啶残基被甲基化后，可影响DNA的物理特性，如：降低Z-DNA形成的自由能，增加DNA的螺旋程度，改变DNA十字形突出的动力学特性。由于在化学测序过程中联*的反应性降低，5-甲基胞嘧啶的位置易于确定下来。
4．MgCl2并不是必需的辅因子。Mg2+存在时，M.Sssl更倾向于分散甲基化，而不是连续甲基化，同时，M.Sssl还具有拓扑异构酶的活性。

活性定义：1单位指在20μL反应体系中，37℃条件下，1小时能保护1μgλDNA不被BstUl限制性内切酶切割所需要的酶量。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。


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·5M甜菜碱溶液，PCR级
编号：BTN70902
英文名称：Betaine Solution, PCR Grade
规格：1.5mL
本产品为浓度为5M的甜菜碱的水溶液，可以直接加入到PCR反应或测序反应中提高扩增或测序的效率，其详细的用途包括：
1. 降低富含GC的模板形成二级结构的可能,有助于富含GC的模板的PCR扩增和测序。
2. 降低变性温度对碱基的依赖性。
3. 提高LA-PCR的扩增效率。
4. 提高Taq DNA聚合酶的稳定性。

储存条件：低温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：将本产品加入PCR反应体系中，使其终浓度在1.0-1.7M之间即可。其他按常规操作进行即可。


·石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒
编号：BTN130888
英文名称：FFPE Total Protein Extraction Kit
规格：50次
石蜡包埋组织是很重要的临床材料，研究其正常细胞和疾病相关的细胞，特别是癌细胞中标记蛋白的差异表达水平，对于判断癌化的进展，癌症的类型的判定，以方便于诊断和治疗有重要的意义，然而体外培养的细胞的蛋白差异表达水平并不能够真实反映体内细胞的真实状况，因此从石蜡包埋组织中提取蛋白并且加以研究有很重要的意义，本试剂盒通过特殊的快速脱蜡试剂和蛋白质抽提试剂，在两种不同的温度条件下温育，可以将被铰链的蛋白质释放出来，经过简单的离心步骤，上清中含有的蛋白经过沉淀洗涤和溶解后，可以用于Western Blot 、SDS-PAGE、ELISA、2D电泳或蛋白质芯片分析等，本试剂盒可以使用50次左右。

产品特点：
1. 不含有去污试剂，适用于非染色的标本。
2.可以适用于甲醛浸泡的组织标本。
3. 不需要超速离心，可以同时处理多个标本。

试剂盒组成：

成份	规格
预处理试剂A	100mL
预处理试剂B	5mL
提取试剂	5mL
沉淀试剂	75mL
DTT干粉	80mg
使用手册	1份

储存条件：常温下运输和保存，但DTT和提取试剂需要4℃保存，盛装预处理试剂A的瓶子已经密封，请在使用后，将剩余的预处理试剂A倒入一个有内盖的瓶中，同时盖紧内外盖，以防止挥发。盛装预处理试剂A，B和沉淀试剂的瓶盖要盖紧，同时避免火源。

使用方法：
1. 取两块大约10-15μm厚，100mm2石蜡包埋组织切片到1.5mL的干净离心管中，加入1mL预处理试剂A，高速涡悬震荡30 sec，室温静置5 min，期间偶尔颠倒离心管数次。
2. 加入100μL预处理试剂B，涡悬震荡10sec，再10000rpm(10000g)离心2min，移去上下两层的液体。
3. 用500μL的超纯水清洗脱蜡的组织两次，离心并尽量吸去液体，保留组织块沉淀。
4. 加入100μL提取试剂(用前需要将DTT全部加入到装提取试剂的瓶中，摇晃混匀，未用完的提取试剂需要4℃放置)，盖上盖子，涡悬震荡数秒。
5.在水浴锅中100℃加热20 min，短暂离心一下，再用组织研磨棒将切片组织磨碎。
6.在水浴锅中60℃加热2 hour，期间大约每20 min取出，震荡一次。
7. 4℃，12000rpm(12830 g)离心15 min，小心将上清转移到一个新的1.5mL的干净离心管中。注意：在上清中的蛋白质可以在4℃的环境条件下保存一个星期，如果需要长期保存，请放置在-20℃的环境中，同时避免 反复冻溶，也可以使用我公司生产的非干扰型蛋白浓度测定试剂盒对上清中的蛋白质直接定量。
8. 加入1mL的沉淀试剂，涡悬震荡10 sec，在4℃的环境中保持10 min。
9. 4℃，12000rpm离心15 min，去除上清，保留沉淀。
10. 加入0.5mL的沉淀试剂，涡悬震荡10 sec，在4℃的环境中保持10 min，再4℃，12000rpm离心15 min，去除上清，保留沉淀，在通风橱中将试管倒置在滤纸上，让残余的液体挥发干净。
11. 将固体沉淀溶解于合适的自备的缓冲液中，再4℃，12000rpm离心5 min，收集上清，用于SDS-PAGE，Western blot等实验。注意：此上清中含有DNA，RNA 残留，所以溶液有些发粘，加入少量的micrococcal nuclease，benzonase等消化，有助于减少粘性，但是即使不处理一般不会影响后续实验，用枪头将沉淀捣碎。建议使用含有Thiourea ，Urea，NDSB-201或其它强溶解能力的去污试剂的缓冲液有利于沉淀的完全溶解。

注意事项：
1. 为提高石蜡包埋组织中蛋白质的回收效率，必须尽量减少在切片制作过程中甲醛固定时间，同时在石蜡包埋前彻底脱水，甲醛固定的时间越长，蛋白质的提取回收效率越低。
2. 尽量取用从石蜡包埋组织块中切取的薄片，或没有封闭到载玻片上的没有经过苏木精等染色的切片。
3. 材料越新鲜或甲醛固定时间越短，蛋白质的回收效率越高。
4. 提取试剂中含有含有刺激性的化合物，操作时要戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻，沾染皮肤 眼睛后，立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。
5. 对于甲醛浸泡的组织样本，每次可以取5-10mg的组织样本，用双蒸水洗涤离心收集后后，直接从步骤4开始操作。
6. 提取的蛋白沉淀如果用于ELISA、RIA等免疫实验，可能需要先进行抗原修复程序，但是如果用Western Blot或Dot blot实验，一般情况下没有必要。
7. 本试剂盒只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等，由此产生的后果概不承担责任。

北京百莱博科技有限公司专业生产蛋白质研究产品，欢迎来电咨询选购动植物膜蛋白微量制备试剂盒现货。