预混型BCIP/NBT溶液库存

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

百奥莱博专业生产销*(代"售")预混型BCIP/NBT溶液库存，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：预混型BCIP/NBT溶液库存
英文名：Premixed BCIP/NBT Solution
规格：250mL
品牌：百奥莱博
产地：国产|进口
本产品是在BCIP/NBT底物显色试剂盒(BTN81224)的基础改良而得的升级产品。

产品特点：
1．含有BCIP和NBT 两种成分的混合液，不需混合和稀释，直接使用，十分方便。
2．在碱性磷酸酶存在时形成暗紫色沉淀，具有和其他AP底物(包括分开提供的BCIP/NBT溶液)一样的灵敏度。
3．稳定，使用精心优化的溶剂，在低温条件下可以保存一年。
4．可用于Western Blot。

储存条件：常温运输和保存(避光)，有效期一年。

自备试剂：Western印迹膜洗膜液(BTN81211)或TBST缓冲液。

使用方法：
1．按常规方法进行Western 印迹膜杂交，直到跟二抗-AP 复合物保温这步结束。
2．用Western 印迹膜洗膜液洗印迹膜5次，每次至少1分钟。注意：可以用TBST缓冲液代替Western 印迹膜洗膜液。
3．用水迅速冲洗一次。
4．将印迹膜转移到本产品中(每cm2印迹膜需要0.1mL本产品)，室温平缓摇晃5-30分钟显色。37℃可加速反应。
5．细心观察蛋白条带的颜色变化，显色到满意程度后(一般需要20分钟，具体跟蛋白浓度密切相关)迅速将印迹膜转移到盛有超纯水的托盘中摇晃，终止显色反应。数分钟后需要换水，共三次。
6．用吸水纸吸干膜上的水分，照相或扫描处理后避光干燥保存印迹膜。

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·血液RNA柱式提取试剂盒
编号：BTN71202
英文名称：Blood RNA column Extraction Kit
规格：50次
本试剂盒是在血液RNA提取试剂盒(BTN3071)基础上开发的柱式升级产品，专门从动物全血样品中快速提取总RNA。

试剂盒特点：
1. 比BTN3071更加简单快捷，直接使用新鲜的或冷冻的抗凝全血样品，不需裂解红细胞等任何预处理步骤，整个提取过程只需要十分钟左右，可以全在室温下进行。
2.产量和纯度更高，OD260/280 均在2.0左右，产率一般为2-5μg/mL人血。
3. 每次微量提取的最大样品处理量可以达到1.5mL，高于进口的同类产品。
4.与常用的抗凝剂(包括肝素，EDTA，柠檬酸*，草酸*)兼容，得到的RNA可以直接用于RT-PCR和Northern杂交等研究。

试剂盒组成：

 

成分	50T
溶液A	50ml
溶液B	15ml
溶液C	50ml
离心吸附柱	50套
通用洗柱液	50ml
RNA洗脱液	10ml
说明书	1份

储存条件：常温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：
1. 将0.2-1.5mL 新鲜或解冻后的抗凝全血加入到1.5mL塑料离心管中。
2. 12000～15000g室温离心3分钟，弃上清(血浆)。如果此时血液细胞沉淀体积大于0.2mL，则需要减少血液的使用量，具体减少量需根据具体情况决定，因为各个个体(尤其是患者)血液中白细胞数目差别很大。
3. 将1mL溶液A加入到血液细胞沉淀中，用移液枪吹打沉淀使细胞裂解。
4. 将0.3mL的溶液B加入到离心管中，剧烈震荡30秒。
5.和0.2mL *仿加入到离心管中，剧烈震荡30秒。
6. 12000～15000g室温离心3～5分钟，将上清液(为无色或浅红色，约0.5-0.9mL)转移到另一干净离心管中。注意：转移的液体不要超过0.7mL，否则下一步不能加入等体积的溶液C。为防止污染，最好留100μL左右的上清液。下层有机相一般呈深红色，中间层为白色，含有DNA，蛋白质和其他细胞破碎物，避免触及或吸取。
7. 加入等体积的溶液C，充分颠倒混匀。
8. 分两次将溶液转移到离心吸附柱中，每次转移后12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液。
9. 加0.7mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。
10. 如果有必要，可以再加0.3mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。注意：增加此步可以进一步提高RNA的纯度。
11.室温12000～15000g离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响RNA的后续反应。
12. 将离心吸附柱转移到一个RNase-free的收集管中，加入50-100μL RNA洗脱液，室温放置1-2分钟。
13. 12000～15000g室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
14. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子(BioTechniques，28：414，2000)。
15. RNA产量产率测定：将5-10μL RNA溶于TE缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度(1 OD260的RNA=40μg/mL)，进而计算出RNA的产量(浓度X体积)和产率(RNA产量/组织用量)。人血RNA产率一般为2-5μg/mL。
16. RNA 纯度测定：无污染的总RNA的OD260/OD280一般在2.0左右(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR等反应。

疑难解答：
Q：如何去除RNA样品中的DNA污染？
A：可以使用百奥莱博的非酶DNA 清除剂DNA ERASOL-2。
Q：为何有的样品在第6 步离心后有很厚的中间层，上清很少。
A：这是因为蛋白质变性不充分，可以适当减少血液的用量。白细胞多的血液容易产生这种情况。
Q：离心吸附柱的RNA 最大吸附量是多少？
A：是40μg。



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·膜结合DNA清除试剂盒
编号：BTN90904
英文名称：Membrane-Bound DNA Scavenger
规格：50次
本试剂盒是在无RNase的DNase(BTN90903)的基础上开发的、专门用于在柱式法总RNA抽提过程中，清除硅胶膜上基因组DNA污染的产品。

产品特点：
1.快速，反应条件经过优化，能在5分钟内使硅胶膜上的基因组DNA降解。
2. 不含RNase，可以保证RNA分子完整性不受任何影响。
3. 兼容性广，跟大多数柱式RNA提取试剂盒兼容，可以直接整合进去。不需要在提取到总RNA后再单独去除里面的DNA污染。

试剂盒组成：

成分	规格
RNase-free DNase(1U/μL)	0.5ml
膜反应液	2.5ml
通用洗柱液	50ml
RNA洗脱液	10ml
说明书	1份

储存条件：低温运输、-20℃保存，通用洗柱液和RNA 洗脱液可以室温保存，有效期一年。

使用方法：
1. 将0.5mL 通用洗柱液加入到已经结合了DNA和RNA的硅胶膜离心吸附柱中，12000rpm室温离心10-30秒。注意：不能使用离子交换吸附柱，Qiagen公司的部分产品使用的是离子交换吸附柱，一部分是硅胶膜离心吸附柱，一定要在实验前弄清楚。
2. 配制DNase工作液50μl，即将10μl RNase-free DNase 加入到50μl膜反应液中，在离心管中吹打混匀。注意：对一般的mini型离心吸附柱，膜反应液和DNase的总体积不要大于60μl，否则酶的浓度将降低，影响DNA去除效果。
3. 将上步得到的混合液全部转移到第一步预洗得到的离心吸附柱中。
4.室温放置5分钟。注意：5分钟一般足够降解大多数情况下的DNA污染。如果DNA没有彻底降解(可能由于样品中残留的杂质抑制了DNase的活性)，此步的保温时间可以适当延长，直到彻底清除为止。
5. 保温结束后，直接在离心管中加入0.5mL的通用洗柱液，12000rpm室温离心10-30秒。
6.干甩一次(12000rpm室温离心10-30秒)。
7. 将30-100μl RNA 洗脱液加入到离心吸附柱的膜中央，12000rpm室温离心10-30秒，洗脱液即是无DNA的RNA样品。可以立即使用或放-70℃长期保存。


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·基因转染增强剂
编号：BTN140621
英文名称：Hexadimethrine bromide
规格：0.5mL
聚凝胺Polybrene又名为*化己二甲铵、海美*铵，CAS号：28728-55-4。聚凝胺是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA转染实验以增强转染效率。Polybrene 增强转染效率原理图如下：


产品特点：
1．Polybrene广泛应用于脂质体转染、逆转录病毒介导的基因转染及慢病毒介导的基因转染等实验，可以显著提高各种逆转录病毒、慢病毒及脂质体的转染效率。
2．Polybrene对某些细胞(如末端分化的神经元，DC细胞)毒性较大，初次应用建议先做毒性测试。
3．Polybrene还是一种有效的抗肝素剂(肝素拮抗剂)，常用来生产非特异性凝集的红细胞；还可用于蛋白测序，小剂量的Polybrene在自动测序分析可明显改善多肽的降解现象；PVDF 膜上加入Polybrene能提高膜的亲和性。

储存条件：低温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：

慢病毒感染举例：
1．第一天按实验需要将细胞铺板(比如24孔板)。细胞数以第2 天密度约50%为宜。37℃培养过夜。
2．第二天感染前，从-80℃冰箱取出病毒，冰浴融化，参考相关文献或者根据预实验得到的MOI 值用新鲜完全培养基将病毒稀释成所需浓度。
 注意：轻轻混匀，不要使用振荡器。
3．吸去细胞原有培养基，将按照MOI 稀释好的病毒液+培养基+ Polybrene(对于293细胞，终浓度6μg/mL)加入细胞中，轻轻摇匀。37℃培养过夜。
 注：病毒液-培养基-Polybrene 混合液，按如下操作制备混合液：
①添加完全培养基(60mm培养皿2mL，100mm培养皿3mL)，37℃预热；
②加入病毒轻轻混匀；
③加入Polybrene 至终浓度为2μg-12μg/mL。
轻轻混匀。以上每个成分需要按顺序加入。当MOI高于20时，建议客户添加Polybrene(终浓度2～12μg/mL，浓度因不同的细胞而异，具体的请参考相关文献)来提高病毒的感染效率。如果感染目的细胞是Jurkat，kasumi，NB4，H929，GBC-SD，MCF-7等，建议不要添加Polybrene；大部分原代细胞感染也不需要添加Polybrene，以上仅供参考。
4．感染48小时后，吸除含慢病毒的培养基，换为新鲜的培养基。
5．继续培养24～48小时后，根据需要收集细胞检测目的蛋白的表达。

质粒转染：
1．第一天按实验需要将细胞铺板(比如24孔板)。细胞数以第2 天密度约50%为宜。37℃培养过夜。
2．准备 DNA-培养基-Polybrene混合液。按如下操作制备混合液：
①添加完全培养基(60mm培养皿2mL，100mm培养皿3mL)，37℃预热；
②添加10ng～10μg质粒轻轻混匀；
③加入Polybrene 至终浓度为5μg-10μg/mL。
 轻轻混匀。以上每个成分需要按顺序加入。
3．去除培养基，在细胞中加入DNA-培养基-Polybrene溶液，在37℃孵育细胞6-20h。细胞培养的前6h内约每1.5h 轻柔混匀。
4．去除 DNA-培养基-Polybrene溶液。用DMSO shock solution(15%DMSO in 1×HBSS)轻轻盖住细胞(60mm培养皿3mL，100mm培养皿4mL)。每次加入溶液时用手轻晃培养盘10s，使得液体均匀分布。然后37℃孵育细胞4min。
5．立即去除DMSO shock solution，用完全生长培养基轻轻清洗细胞2次。对于60mm培养皿每次用5mL培养液清洗，100mm培养皿每次用10mL培养液清洗。
6．加入完全培养基到细胞中，根据需要进行后续实验。
 稳定转化：去除生长培养基，按照1:5的比例用选择培养基裂解细胞。
 瞬时表达：去除生长培养基，加入新鲜的生长培养基。24-72h后收获细胞。

备注：Polybrene的使用浓度依据细胞种类，转染方法等影响，以下使用浓度仅作参考。
1．为提高腺病毒转染效率和LacZ转基因表达，使用6μg/mL Polybrene处理病毒载体后转入BHK-21细胞(MOI为100)，转染率提高到95%，没有用Polybrene处理的只有2.3%转染率。
2．在KSHV(Kaposi"s sarcoma-associated herpesvirus)纯化和转染实验中，浓缩的病毒与8μg/mL Polybrene加到BCBL-1细胞中37℃下孵育2h。
3．在逆转录病毒构建研究中，用v-rasHa 逆转录病毒转染角质细胞(Keratinocytes)后在含有4μg/mL Polybrene培养基中培养3天，病毒滴度为1×107 virus/mL，MOI 为1。
4．在shRNA编码的慢病毒载体的转染研究中，病毒上清中加入8μg/mL Polybrene，转染到HEK293细胞中。
5．在慢病毒shRNA转染研究中，将含有6μg/mL Polybrene的新鲜培养基加入到培养24h的RCC10细胞中，用慢病毒颗粒转染细胞。

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