HE染色/Tunel染色/特殊染色/免疫荧光/masson染

HE染色全名为苏木jing(hematoxylin)和伊红(eosin)染色方法，是最基本的也是最重要的病理学染色技术。

       HE染色是目前国内外病理诊断上广泛采用的 常规染色方法。一张好的HE切片是保证正确病理诊断的关键。切片质量的好坏，可直接影响疾病诊断的及时与准确性。作为一个合格的实验技术员，能制作出一张高质量的HE染色切片，是必须掌握的一门重要功课。
        HE染色的实验原理及注意事项
       一、细胞核染色原理：
       苏木jing为碱性天然染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木jing碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木jing在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。
       二、细胞浆染色原理：

       细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时，大于蛋白质的等电点pH值，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染色，现时胞核也被染色，核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织，嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。

三、分化作用：
       染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程称为分化作用，所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液，因酸能破坏苏木jing的醌型结构，使组织与色素分离而褪色。经苏木jing染色后，必须用0.5%盐酸乙醇分化，使细胞核过多结合的苏木jing染料和细胞浆吸附的苏木jing染料脱去，在进行伊红染色，才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此，在HE染色中分化是极为关键的一步。
       四、返蓝作用：
       分化之后，苏木jing在酸性条件下处于红色离子状态，呈红色，在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色，故分化之后，立即用水除去组织切片上的酸而终止分化，再用弱碱性水（0.2%an水）使苏木jing染上的细胞核呈现蓝色，这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝，但所需时间较长。
       实验材料
       固定液：常用95%乙醇和冰丙tong
       苏木jing染液：称取苏木jing粉0.5g，铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中，然后取NaIO 31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰cu酸2ml，混合均匀，滤纸过滤，备用。
       伊红染液：称取0.5g水溶性伊红染液，溶于100ml蒸馏水中。
       稀盐酸乙醇溶液：用75%乙醇配制1%盐酸。
       系列浓度的乙醇、二甲苯、中性树胶。
       培养瓶、培养皿、眼科镊、盖玻片、载玻片、显微镜。
       实验步骤
       样品制备：对于贴壁生长细胞，胰酶消化，调整细胞浓度约1×105/ml，滴加于盖玻片上(置于6孔板中)，培养相应时间后，取出细胞爬片，用PBS 洗涤3次。
       样品固定：95%乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次1min。
       染核：苏木素染液染色2-3min，自来水洗涤。
       分色：镜下观察，若细胞核染色过深，用1%盐酸酒精溶液分色数秒，自来水洗涤。
       染胞质：浸入伊红染液染色1min，自来水洗涤。
       吹干或自然晾干细胞 爬片后，中性树胶封片。
       若细胞用4%多聚甲quan固定，则染色时间相应延长，苏木素染色12-15min，伊红5min即可。
       实验结果及注意事项

       实验结果

       细胞核呈蓝色，细胞质，肌纤维，胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。钙盐和细菌可呈蓝色或紫蓝色

       注意事项：
       1.  染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰cu酸。
       2.  切片染苏木jing后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。
       3.  切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水jiu精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。

       4.  在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。

       5.  切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。

       6.  最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。

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赛百慷( 上海 )生物技术股份有限公司( iCell Bioscience Inc，Shanghai )是一家专注于研发生产高品质原代细胞、细胞系、干细胞以及相关生物学试剂，并提供专业生物医学技术服务外包的高新技术企业，公司总部位于上海。

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