预染蛋白Marker(11～180kD) 蛋白质研究

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

预染蛋白Marker(11～180kD) 是高品质的蛋白质研究产品，由北京百奥莱博供应，用于科研实验，本产品质量好，且极具价格优势，深为用户称道，了解更多预染蛋白Marker(11～180kD)等蛋白质研究产品请联系我司咨询订购。

名称：预染蛋白Marker(11～180kD) 蛋白质研究
品牌：百奥莱博
规格：200μL
编号：BTN151201
产地：国产|进口
本产品包含10种彩色预染的已知分子量标准蛋白(预染marker)，分子量范围为11-180kDa，每种蛋白含量约为0.2～0.4mg/mL。预染marker可以用于直接观察蛋白质电泳状况以及清晰地判断Western Blot的转膜效果。经SDS-PAGE凝胶电泳或转移到PVDF或NC 膜上可得到清晰的10 条彩色蛋白条带，其中25kDa为绿色条带，75 kDa 为红色条带，其余8 条是蓝色条带。


产品特点：
1．三色预染，颜色鲜亮，条带整齐，便于观察。
2．稳定性能突出，经检测 4℃放置两年无明显降解。
3．用量少，节约成本，仅5μL即可完美呈现(1.5mm，10孔梳)。
4．广谱多带，一支即可满足多种实验需求。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

注意事项：
1．本产品含有较高浓度甘油，常规-20℃保存为液体状态，可直接使用。若冰箱温度不稳，导致结冰，可适当分装后置于4℃保存，至少稳定6个月。
2．本产品分离效果与PAGE胶浓度相关，若分离胶浓度低于15%，25kDa以下条带不易分离，但不影响绿色(25kDa)及以上条带。如果目的条带小于25kDa，建议分离胶浓度大于或等于15%。
3．转膜效果与转膜时间有关，需根据客户目的条带大小而定，如果转膜后较大分子量条带有部分未转膜成功，属于正常现象。

使用方法：
1．本产品是即用型液体，可直接上样电泳。上样前无需加热、稀释或添加还原剂。
2．上样5μL，SDS-PAGE电泳过程及转膜后可看见清晰的彩虹条带。
3．建议分离胶浓度为15%。

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·96孔板血液DNA提取试剂盒(真空法)
编号：BTN131194
英文名称：96 Microwell Plate Blood DNA Extraction Kit
规格：1次

·壮观霉素溶液
编号：BTN131232
英文名称：Spectinomycin Solution
规格：10mL
本产品为浓度50mg/mL的壮观霉素溶液。壮观霉素(奇霉素； 放线菌壮观素；actinospectacin)。分子式：C14H24N2O7，分子量：495.35，CAS号：22189-32-8。壮观霉素属于*基糖苷的抗菌素。与链霉素不同，它不会发生mRNA的误读，但能与细菌的30S核蛋白体结合而阻碍蛋白质的生物合成。在壮观霉素的抗药性菌株，其30S核蛋白体中被称为“S5”的蛋白质可看到有变异。

储存条件：常温运输、4℃避光干燥保存，有效期一年。

·大肠杆菌DH10B电击感受态细胞
编号：BTN160901
英文名称：E.coli DH10B Electroporation-Competent Cell
规格：50μL×5
 本电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。DH10B菌株来源于MC1061菌株，mcrA、mcrBC 及mrr突变使DH10B菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA(无论真核生物还是原核生物的基因组DNA 都能被高效的转入DH10B中)。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。φ80dlacZΔM15 标记的存在使DH10B可用于蓝白斑筛选，rpsL 赋予其链霉素抗性。DH10B电击感受态细胞适用于大质粒的构建或者各种文库构建。本感受态细胞经特殊工艺制作，经 pUC19质粒检测，转化效率>1010cfu/μg。
 菌株基因型为：[F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1endA1 araD139 Δ(ara，leu)7697 galE15 galK λ- rpsL nupG。

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期半年。

自备试剂：目的DNA、SOC培养基等。

使用方法：
1. 将0.1 cm的电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的DH10B电击感受态细胞插入冰中5分钟，待其融化，加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP 管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。(注：对于质粒，测定转化效率使用1μl 10 pg/μL的对照质粒pUC19；对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液(10mM Tris HCl，pH7.5; 1mM EDTA)重悬，DNA浓度不超过100 ng/μL，体积不超过5μL/50μL感受态。)
3. 用 200μl 枪头(用刀切除0.5 cm 枪尖)将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。
4.启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=2.4 kV(此为BioRad电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作)，将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。
5. 向电击杯中加入700μL 不含抗生素的无菌培养基 SOC.，混匀后转移到空EP 管中，37℃，200rpm 复苏60分钟。
6. 5000rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200μL 涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。平板上(因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作，将平板放 37℃培养至少13小时。

注意事项：
1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
2.电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
3. 当 DNA 不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
4.电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
6. 对于连接产物转化，最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液(10mM Tris HCl,pH7.5; 1mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μL。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。
7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。
8.转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
9.电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。


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3671-99-6 D-Glucose6-phosphate 葡萄糖-6-磷酸二*
2-脱氧-2-*-D-葡萄糖 Diethyl acetamidomalonate 29702-43-0
ET108 High Affinity HotStart Taq
BTN61203 高GC DNA清除剂,PCR级 High GC DNA Erasol
环磷酸腺苷 Lithocholic acid 60-92-4
ARB11474 人胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)ELISA代测服务 Human insulin-like growth factors binding protein 2,igfbp-2 ELISA KIT
亚硫基二乙酸 Actidione 123-93-3
53123-88-9 Rapamycin 雷帕霉素
PY08-025  三糖铁琼脂斜面  10支/盒，用于革兰氏阴性肠杆菌的生化鉴定
36051-31-7 5′-三磷酸鸟苷三* Guanosine5-Tiphosphate (GTP)
HC0035 Transwell 聚碳酸酯膜嵌套8.0um
硫*(代"酸")阿米卡星 Erythromycin ethyl succinate 39831-55-5
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·一管式点突变试剂盒
编号：BTN100212
英文名称：One-Tube Mutagenesis Kit
规格：10次
基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。但传统的方法需要使用单链DNA 模板，而得到单链DNA 模板又需要先将基因克隆到类似M13 这种载体中，操作过程冗长。为了克服这些缺点，本公司将突变位点设计到一对互补的引物中，用高保真扩增质粒模板，然后用Dpn I 去除原始的甲基化模板，新合成的DNA 通过互补形成带切口的双链质粒，直接用于转化感受态细菌。

产品特点：
1. 直接使用质粒DNA作为模板，免去了制备单链DNA的步骤。
2.基于高保真PCR，对模板DNA 序列没特殊要求，可以用于突变任何序列。同时对模板的需求量很少。
3.一管式，全部在一个优化的缓冲体系中完成，非常简单。
4. 使用Dpn I 去除未突变模板，突变效率高达90%。
5.可用于制备点突变，缺失突变和插入突变。
6. 本产品A型适用于8 kb以下，B型适用于8-15 kb。

试剂盒组成：

 

成分	10T(A型)	10T(B型)
高保真酶A型	10μl	无
高保真酶B型	无	10μl
5×高保真酶Buffer A型	100μl	无
5×高保真酶Buffer B型	无	100μl
dNTP(2.5mM each)	50μl	50μl
Dpn I酶	10μl	10μl
超纯水	1ml	1ml

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、引物设计及注意事项
用于特定基因突变的引物必须用户单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计。
1. 共需设计两条完全互补的一对引物，它们覆盖要扩增的突变区位点，突变位点最好放在引物的中心。可以先集中设计一条，然后就可得互补的另一条引物。
2.引物的长度通常为25-45个碱基。引物中突变位点任何一侧都必需满足Tm大于45的条件，Tm 计算方式为Tm=4×(GC 碱基数)＋2×(AT 碱基数)。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就达到此标准，它的突变位点AAG 所放位置使左侧Tm＝46；右侧Tm＝48，均大于45。
3. 尽量把引物的GC含量控制在40％-60％，结尾的1-3个碱基最好是G或C。
4. 尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。
5. 最好使用经过PAGE 纯化的引物或更高纯度的引物。

二、待突变模板质粒的选择
1. 必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变，否则Dpn I 不能把没有酶切的质粒DNA 切除，产生大量的假阳性。常用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。不能使用JM110和SCS110以及其它dcm-菌种。
2. 待突变质粒和目的基因的GC含量应该在40-55％，没有任何GC含量超过70%、长度在50bp以上的区域。如果质粒GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果突变位点在高GC 区，则可以使用高GC 专用PCR反应试剂。

三、基因定点突变反应
1.在一个塑料离心管中加入下列成分：

待突变模板质粒	0.1-0.5μg
5×高保真酶Buffer	10μl
引物一(10-20 uM)	1μl
引物二(10-20 uM)	1μl
dNTP Mix(2.5mM each)	4μl
补水到	49μl

2. 加入1μl高保真DNA聚合酶，混匀，如果PCR仪没有热盖则需要加少量石蜡油。放入PCR仪器中按下面参数进行PCR：

步骤	温度	时间	循环数
变性	95℃	1min	1次
PCR	95℃	40s	18次
	60℃	1min
	68℃	1min/Kb
延伸	72℃	10min	1次
保存	4℃	长时间保持

四、Dpn I消化
PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1μL Dpn I内切酶(该酶在甘油保存液中会下沉到管底，故用前需要充分混匀)。DpnI可以酶切双链都被甲基化的模板质粒，也能降解一条链被甲基化的双链质粒。混匀后37℃孵育2小时后样品可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。

五、转化、挑克隆鉴定：
每100 微升感受态细菌(转化效率必须在107/μg以上)中可以加入5-10微升经过Dpn I 消化后的突变产物，按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作。如果PCR 使用了石蜡油，在转化时千万别把它带入转化反应，否则会严重影响转化效率。
在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌全部涂布到含有适当抗生素的平板上培养过夜。通常会得到50个以下的克隆，可按常规方法制备质粒并测序。

六、常见问题：
1.转化后没有克隆或克隆数极少：
(1)感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在107/μg。
(2)把Dpn I 消化后的产物用常规的乙醇沉淀浓缩，这样就可以把所有的产物全部用于转化。
(3)优化基因定点突变中的PCR参数。可以把最初的95℃变性时间延长为2分钟，循环中95℃变性的时间延长至1分钟，把循环中的68℃的延伸时间改为1.5分钟/kb 至2分钟/kb，退火可以改为60-55℃或65-55℃等的touch down，退火时间也可以适当延长。
(4)引物设计有问题。通过突变反应中的PCR 没有很好地扩增出预期的突变质粒。
2.有克隆，但没有或很难检测到预期的突变克隆：
使用的待突变的模板质粒量过多，导致Dpn I 消化时不完全，可减少质粒用量。
3. 有突变克隆，但突变位点不是预期的位点：
(1)引物设计不佳，退火温度过低，导致引物退火到错误的地方。
(2)引物质量较差，没有经过PAGE 纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物，容易导致非预期的突变。

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