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XL10-Gold Chemically Competent Cell
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北京百奥莱博科技有限公司
特别声明:本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品,严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。
北京百奥莱博专业生产供应北京XL10-Gold化学感受态细胞厂家,我公司销*(代"售")全品类的分子生物学试剂,价格优惠,欢迎广大科研工作者垂询订购。
名称:北京XL10-Gold化学感受态细胞厂家
英文名:XL10-Gold Chemically Competent Cell
规格:100μl×10管
编号:SY0018
品牌:百奥莱博
XL10-Gold化学感受态细胞是经特殊工艺处理得到的感受态细胞,特别适合于大分子量DNA的高效转化。具有四环素和*霉素抗性,使用Puc19质粒测得其转化效率达108cfu/μg,
本品基因型:TetrΔ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [F´proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]。
主要具有如下特点:
① Hte表型可增强较大分子量质粒和连接产物的高效转化;
② 具有限制性内切酶缺陷性,更利于克隆 DNA 的稳定和高纯度质粒 DNA 的提取;
③ 更适于质粒文库的构建;
④ 具有lacIqZΔM15,可用于蓝、白斑筛选。
注意事项
1)感受态细胞应保存在-80℃,不可反复冻融和放置时间过长,以免降低感受态细胞的转化效率。
2)整个转化操作,严格根据相应温度及无菌条件要求进行。
3)为确保最高转化效率,整个操作过程应尽量轻柔,并保持低温,且每次转化感受态使用量,不低于100μl。
4)为防止转化不成功,可以保留部分连接反应液,以重新转化,最低化实验可能遇到的风险。
使用方法
1)取100 μl感受态细胞置于冰浴中融化。
2)向100μl感受态细胞悬液中加入0.1-50ng(<10μl /100μl感受态)目的DNA或2μl连接产物,轻轻旋转离心管以混匀内容物,在冰浴中静置30min。
3)置于42℃水浴中热激30s,然后快速将管转移到冰浴中,冷却2-3min,该过程不要摇动离心管,否则会降低转化效率。
4)向离心管中加入900μl 42℃预热的无菌NZY+培养基(不含抗生素),混匀后置于37℃摇床振荡培养1h(225-250rpm),目的是促使菌体复苏。
【注】:此步也可用LB培养基(不含抗生素)进行菌体复苏。
5)取上述≤200μl转化产物涂至含有相应抗生素的LB固体平板上,将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
【注】:如需做蓝白斑筛选,需至少孵育17h,以充分显色。
储存条件:-80℃
北京XL10-Gold化学感受态细胞厂家正在火爆热销,除此之外,为您推荐下别热销产品:
·S-Tag 多肽
编号:SY0427
英文名称:S-Tag (Pancreatic RNase A derivtive) Peptide
规格:5mg
S-Tag 多肽(S-Tag (Pancreatic RNase A derivtive))是一种合成的多肽,由15个*基酸构成。在免疫分析实验中,S-Tag Tag多肽与S-Tag融合蛋白竞争性结合anti-S-Tag抗体。用于洗脱S-Tag融合蛋白时,S-Tag多肽的推荐工作浓度是100-400μg/ml。
多肽序列(Amino acid sequence):H-Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser-OH
分子式:C73H117N23O25S
分子量:1748.91
外观:白色粉末
纯度:>99%
溶解性:溶于水或1%醋酸
储存条件:-20℃,有效期1年
·HRP标记小鼠抗GST-tag单克隆抗体
编号:SY0659
英文名称:HRP-conjugated GST-tag, Mouse mAb
规格:10μl(>50次)
本品为HRP标记小鼠抗GST-tag单克隆抗体,HRP标记小鼠抗GST标签单克隆抗体。推荐稀释比例:WB(1:5000~50000)。
融合蛋白表达中通常在蛋白N-端或C-端加上特定蛋白或多肽序列作为一种抗原表位(标签蛋白)以便于目的蛋白后续的定位、表达、检测及纯化。Glutathione S-Transferase (即谷胱甘肽S-转移酶,GST)是应用非常广泛的一种蛋白标签,来源于Schistosoma japonicum,分子量为26kDa,可应用于各种融合蛋白,可在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达,用GST亲和柱可简便地分离融合蛋白。 GST标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。
GST抗体可以用于GST融合蛋白后续的表达、细胞内定位,纯化、以及定性或定量分析。
产品类型:小鼠单抗(mouse McAb IgG2a)
分子量:26 kDa
反应性:Recombinant protein, Schistosoma japonicum
免疫原:Recombinant Protein
纯化方式(Purification):Protein A purification
储存缓冲液(Storage Buffer):PBS with 0.02% thimerosal and 50% glycerol pH 7.3。
储存条件:-20℃,避免反复冻融,有效期一年。
北京XL10-Gold化学感受态细胞厂家关键词:XL10-Gold Chemically Competent Cell,SY0018,XL10-Gold化学感受态细胞
·His标签蛋白琼脂糖纯化树脂
编号:SY0392
英文名称:Ni-NTA Agarose Resin
规格:10ml
Ni-NTA Agarose Resin以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸(NTA)为配体,螯合镍离子(Ni2+)后,形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体的中心,这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻,与Ni-IDA树脂相比,更加稳定,可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可获取的树脂之一。
基质(Matrix):高度交联的4%琼脂糖凝胶
孔径(Bead size):45-165µm
载量(Capacity):>40mg 6×His-tagged protein/ml 基质
耐压(Tolerance Pressuremax):0.1MPa, 1bar
储存缓冲液:含20%乙醇的1×PBS
储存条件:4℃,有效期2年。
使用方法
(一)纯化流程
1 缓冲液的准备
缓冲液使用原理:低咪唑上样,高咪唑洗脱,或者高pH上样,低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22µm或0.45µm滤膜过滤除菌。可溶性组*酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组*酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。
2 样品准备
2.1 细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达的蛋白纯化为例)
1)挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中,根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2)表达结束后,将培养液转至离心瓶,7000rpm,离心15min,收集菌体,然后加入1/10体积的裂解液(Lysis buffer)和PMSF(PMSF在破碎前加入,其终浓度为1mM),同时也可加入其他蛋白酶抑制剂,但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3)之后加入溶菌酶,使其工作浓度为1mg/ml。【注】:如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE,可以不加入溶菌酶。
4)将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高,可考虑加入10µg/ml RNase A和5µg/ml DNase I),混匀,置于冰上超声破碎细胞,至菌液基本保持澄清。
5)收集上述澄清蛋白液,10000rpm,4℃离心20-30min。取上清0.22µm或0.45µm滤膜过滤后置于冰上备用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶,5000rpm离心10min,收集上清。如上清中不含EDTA、组*酸和还原剂等,即可直接上柱纯化;如含有EDTA、组*酸和还原剂等物质,则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】:对于大量体积的上清,需加入硫*(代"酸")铵进行沉淀浓缩,之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵体蛋白纯化(以细菌为例)
1)将培养液转移至离心瓶,7000rpm,离心15min,收集菌体去上清。
2)按照菌体:裂解液=1:10(w/v)的比例将菌体充分悬浮,混匀,冰浴超声破碎。
3)将破碎液转移至离心管,10000rpm,4℃离心20-30min,去上清。可重复步骤2)和3)一次。
4)按照菌体:裂解液(含8M尿素)=1:10(w/v)的比例将包涵体充分悬浮。
5)变性条件下纯化His标签蛋白纯化。
3样品纯化
1)装柱:将Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用装入合适的纯化柱中。
2)清洗:3-5倍柱体积去离子水冲洗色谱柱。
3)平衡:至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。
4)上样:注意控制加样速度,确保目的蛋白与Ni2+充分接触,以提高纯化得率。
【注】:注意收集流出液,用于后续SDS-PAGE检测蛋白的结合情况。
5)平衡/洗杂:Wash Buffer 平衡柱子,直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。注意收集流出液。
【注】:在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6)洗脱:使用5-10倍柱体积Elution Buffer洗脱,收集洗脱液即目的蛋白溶液。
7)清洗:依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。
【注】:建议在清洗之前用更高浓度咪唑(如500mM)彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。
8)保存:5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂,最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中,置于4℃保存。
4 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测,判定其纯化效果。
(二)在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高(>0.5Mpa)或者填料上面出现明显的污染时,需对其进行在位清洗(Cleaning-in-Place,CIP)。在位清洗时,先把Ni2+脱掉,清洗结束后,将填料保存在20%乙醇中,后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
1 去除强疏水结合的蛋白,脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积,接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液,接触时间为1-2h。去污剂处理后,需用70%的乙醇清洗5倍柱体积,彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。
2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min,之后用去离子水清洗10倍柱体积。
(三)填料再生
当填料使用过程中发现反压过高,填料上面出现明显的污染,或填料载量明显变低时,需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理,即填料再生。按照下面操作流程进行:
1)使用0.2M 醋酸溶液(含6M GuHCl)清洗2倍柱体积;
2)去离子水清洗5倍柱体积;
3)2%SDS清洗3倍柱体积;
4)去离子水清洗5倍柱体积;
5)乙醇清洗5倍柱体积;
6)去离子水清洗5倍柱体积;
7)100mM EDTA(pH 8.0)清洗5倍柱体积;
8)去离子水清洗5倍柱体积;
9)100mM NiSO4清洗5倍柱体积;
10)去离子水清洗10倍柱体积。
填料再生后,可立即使用,也可保存在20%乙醇中,置于4℃备用。
附表1 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
缓冲液名称 | 配方 | 配制1L溶液所需各种试剂量 |
Lysis Buffer (pH8.0) | 50mM NaH2PO4 300mM NaCl 10 mM imidazole NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤除菌 |
NaH2PO4 ·2H2O 7.8g NaCl 17.54g Imidazole 0.68g |
Wash Buffer (pH8.0) | 50mM NaH2PO4 300mM NaCl 20 mM imidazole NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤除菌 |
NaH2PO4 ·2H2O 7.8g NaCl 17.54g Imidazole 1.36g |
Elution Buffer(pH8.0) | 50mM NaH2PO4 300mM NaCl 250 mM imidazole NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤除菌 |
NaH2PO4 ·2H2O 7.8g NaCl 17.54g Imidazole 17.0g |
缓冲液名称 | 配方 | 配制1L溶液所需各种试剂量 |
Lysis Buffer (pH8.0) | 8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐*(代"酸")溶液调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤除菌 |
Urea 480.5g NaH2PO4 ·2H2O 15.6g Tris 15.76g |
Wash Buffer (pH6.3) | 8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐*(代"酸")溶液调pH至6.3, 0.22µm或0.45µm过滤除菌 |
Urea 480.5g NaH2PO4 ·2H2O 15.6g Tris 15.76g |
Elution Buffer(pH4.50) | 8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐*(代"酸")溶液调pH至4.5, 0.22µm或0.45µm过滤除菌 |
Urea 480.5g NaH2PO4 ·2H2O 15.6g Tris 15.76g |
试剂种类 | 浓度 |
还原剂 | 5mM DTE 0.5-1 mM DTT 20mM β-mercaptoethanol 5mM TCEP 10mM reduced glutathione |
变性剂 | 8M urea 6M Gua-HCl |
去污剂 | 2% TritonTM X-100(nonionic) 2% TweenTM20(nonionic) 2% NP-40(nonionic) 2% Cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic) |
其他类 | 500mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100mM Na2SO4 1.5M NaCl 1mM EDTA 60mM citrate |
缓冲液 | 50mM sodiu*(代"m") phosphate, pH7.4 100mM Tris-HCl, pH7.4 100mM Tris-acetate, pH7.4 100mM HEPES, pH7.4 100mM MOPS, pH7.4 100mM sodiu*(代"m") acetate, pH7.4 |
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