一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量ROX校正染料)

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博主要从事生物试剂的生产和销*(代"售")，产品线涵盖一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量ROX校正染料)北京厂家在内的分子生物学试剂产品，还包括PCR及荧光定量PCR、核酸提取试剂盒类、样本核酸保护试剂、核酸提取、克隆与转化、蛋白纯化、蛋白检测、免疫组化、细胞凋亡与抗体等。

名称：一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量ROX校正染料)北京厂家
产地：国产|进口
品牌：百奥莱博
规格：100次
英文名：BaldStar TaqMan One Step RT-qPCR Kit(High ROX)
  本试剂盒是采用探针法(TaqMan，Molecular Beacon等)进行一步法Real-Time RT-qPCR的专用试剂盒。使用本产品进行Real Time RT-qPCR反应时，逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，避免了污染的同时提高了实验效率。本产品的检测灵敏度高，荧光信号强，信噪比高，非常适合于RNA病毒等微量RNA的检测。其所包含的特殊缓冲系统能使逆转录酶与DNA聚合酶同时发挥最大功效，提高反应效率。使用本产品可以得到更宽广的线性范围，对目的基因定量更准确，重复性好，可信度高。

  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器:(WE0148)
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器：(WE0149)
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器：(WE0150)
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

试剂盒组成：

 

组份	WE0148-100次	WE0149-100次	WE0150-100次
2×BaldStar TaqMan One Step Buffer	1.4ml	1.4ml	1.4ml
BaldStar TaqMan One Step EnzymeMix	100μl	100μl	100μl
50×Low ROX	-	50μl	-
50×High ROX	-	-	50μl
RNase-Free Water	1.5ml	1.5ml	1.5ml

注意事项：
1、本试剂盒中试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、本产品以RNA为模板进行一步法RT-PCR实验，在操作过程中应避免RNase污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套，实验相关耗材应用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时,并高压灭菌30分钟后使用。
3、本试剂盒中的各试剂应尽量避免反复冻融，反复冻融可能使产品性能下降。
4、本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好坏直接影响到RT-qPCR反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物位置，PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件进行设计。
5、本试剂盒推荐使用特异性探针，建议采用专业的设计软件进行设计。


使用方法：
以下举例为常规的反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小的不同进行相应的改进和优化。(反应液的配置请在冰上进行)

1、将RNA模板、引物、2×BaldStar TaqMan One Step Buffer、BaldStar TaqMan One Step EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2、PCR反应体系：
 

试剂	25μl反应体系	终浓度
2×BaldStar TaqMan One Step Buffer	12.5μl	1×
Forward Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
Probe，10μM	0.5μl	0.2μM
BaldStar TaqMan One Step EnzymeMix	1.0μl
RNA Template	Xμl	10 pg～100ng
50×Low ROX or High ROX(可选)	0.5μl	1×
RNase-Free Water	up to 25μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。
2)使用的探针浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3)通常RNA模板的量以10 pg – 100ng为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
4)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50×Low ROX or 50×High ROX。

3、混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4、RT-PCR反应条件：
 

步骤	温度	时间	循环数
逆转录	45℃	10 min
PCR预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	30-40个循环
退火/延伸	60℃	45 s

注意：
1)1)本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、5-10 min条件下实现酶的活化。
2)建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。

储存条件：-20℃，避免反复冻融

我公司的一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量ROX校正染料)北京厂家，性价比高，货期短，送货上门，欢迎您来电咨询购买，另外，我公司还生产供应销*(代"售")下列产品：

·血液基因组DNA提取试剂盒
编号：WE0176
英文名称：BalbGen Blood DNA Kit
规格：可处理50ml血液|可处理200ml血液
  本试剂盒提供了一种快速、灵活的方法，适用于新鲜或冷冻全血(用柠檬酸盐、EDTA或肝素等抗凝剂处理过的样品)提取总DNA，包括基因组DNA和线粒体DNA。本品可以灵活处理0.1-20ml的全血，采用非离心柱的方法，无需使用*酚、*仿等有机溶剂，有效去除蛋白、色素、脂类及其它抑制性杂质污染。整个过程在一个管中操作，减少了污染及样本混淆的风险。提取的DNA产量高、质量好，可直接用于PCR、荧光定量PCR、酶切和Southern Blot以及文库构建等实验。

试剂盒组成：

组份	可处理50ml血液	可处理200ml血液
Buffer FG1	2×65ml	2×260ml
Buffer FG2	30ml	120ml
Buffer GE	15ml	60ml
蛋白酶K	3 mg	12.5mg
蛋白酶K 储存液	1.25ml	1.25ml

保存条件：Buffer FG1 2～8℃，其他组分室温(15～30℃)。

产品特点
1、纯度高：提取的基因组DNA可直接用于下游PCR、荧光定量PCR、酶切等各种实验。
2、提取量大：可从0.1-20ml的全血中提取DNA，无需使用*酚、*仿等有机溶剂。
3、兼容性强：适用于处理各种血液和细胞样本。

自备试剂：异丙醇、70%乙醇

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、向蛋白酶K 中加入指定用量(0.3ml/1.25ml)的蛋白酶K 储存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
2、所有离心操作均在室温下完成。
3、血液样品反复冻融，会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。所得基因组DNA也应尽可能避免反复冻融，以免降解。如果提取冷冻血液的基因组DNA，建议37℃水浴，迅速解冻后再进行后续操作。
4、血液样品的储存：
1)短期保存：已加入抗凝剂的血液样品可在2～8℃储存最多10天，对于某些实验例 如Southern杂交等，需要得到完整全长的基因组DNA，请将血液样品在2～8℃储存不超过3天，此时基因组DNA的降解程度较轻。
2)长期保存：已加入抗凝剂的血液请置于-70℃保存(如果提取的是高分子量的DNA，推荐使用EDTA作为抗凝剂)。

操作步骤：

一、从100～900μl全血中提取基因组(以300μl血液处理量为例)
1、取300μl全血于2ml离心管(自备)中，加入300μl(样本等体积)Buffer FG1，上下颠倒混匀5次，10000×g离心30秒，弃上清。
2、再向离心管中加入450μl(1.5倍样本体积)Buffer FG1，涡旋震荡，使沉淀完全分散。10000g离心30秒，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置2分钟。
注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。将离心管倒置在吸水纸上，可以减少管壁上清的回流。
3、按照附表配制Buffer FG2与蛋白酶K 的混合液(比例100:1)。
注意：此混合液最好现用现配.井在配好后1小时之内用完。
4、加入150μl的Buffer FG2与蛋白酶K 的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。
注意：
1)如果有多个样品同时操作，加入Buffer FG2/蛋白酶K 混合液后立即涡旋震荡，不要等所有样品部加完后再震荡。
2)通常涡旋震荡3-4次.毎次5秒，可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋震荡后发现沉淀中含胶状物质可以再加入30μl的Buffer FG2/蛋白酶K 混合液，再次混旋混匀。
5、65℃孵育10分钟，其间颠倒混匀数次。
注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿说明蛋白消化完全。
6、加入150μl导丙醇，上下颠倒彻底混匀直至出现丝状或簇状基因组DNA。
注意：与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要。如果样品中白细胞含量少，可能看不到DNA，则至少上下频倒高心管20次确保沉淀完全。
7、10000×g离心5分钟。
注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或増大离心力。
8、弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干。
注意：少数时候沉淀可能贴壁不牢，注意不要吸弃沉淀。
9、加入300μl的70%乙醇，涡旋震荡5秒，10000×g离心5分钟，弃上清。
注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或増大离心力。
10、把离心管倒置于干净的吸水纸上5分钟，确保沉淀在管中 。
注意：在管底可见白色的DNA沉淀，在极少情況下沉淀可能会松弛 ，所以要缓慢倒掉上清。
11、空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净(至少5分钟)。
注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、 PCR等)实验，但避免过度干操DNA沉淀，因过度干燥会使DNA难于溶解。
12、加入200lμl的Buffer GE，低速涡旋5秒，65℃孵育1小时溶解DNA，期间轻弹数次助溶。-20℃保存DNA。
注意：如果DNA没有完全溶解，可室温过夜。如果使用少量的FG3溶解DNA，建议延长孵育时间。

二、从1～5ml全血中提取基因组(以3ml血液外理量为例)
1、取3ml全血于15ml离心管(自备)中，加入3ml(样本等体积)Buffer FG1，上下颠倒混匀5次，2500×g离心5分钟，弃上清。
2、再向离心管中加入4.5ml(1.5倍样本体积)Buffer FG1，涡旋震荡，使沉淀完全分散。2500×g离心5分钟，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置2分钟。
注意：在极少情况下沉淀可能会松弛 ，所以要缓慢倒掉上清。将离心管倒置在吸水纸上，可以減少管壁上清的回流。
3、按照附表配制缓冲液FG2与蛋白酶K 的混合液(比例100:1)。
注意：此混合液最好现用现配，井在配好后1h之内用完。
4、加入1.5ml Buffer FG2/蛋白酶K 混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。
注意：
1)如果有多个样品同时操作，加入Buffer FG2/蛋白酶K 混合液后立即涡旋振荡，不要等所有样品都加完后再震荡。
2)通常涡旋震荡3-4次，毎次5秒可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋震荡后发现沉淀中含胶状物质可以再加入300lμl的Buffer FG2/蛋白酶K 混合液，再次涡旋混匀。
5、65℃孵育10～30分钟，其间颠倒混匀数次。
注意：如果样品额色从红色变成橄榄绿说明蛋白消化完全。
6、加入1.5ml导丙醇，上下颠倒彻底混匀直至看到DNA。
注意：与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要。如果样品中白细胞含量少，可能看不到DNA，则至少上下颠倒离心管20次确保沉淀完全。
7、2500×g离心5分钟。
注意：如果沉淀贴壁不牢，可以造当延长离心时间或増大离心力。
8、弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干。
注意：在管底可见自色的DNA沉淀，在极少情况下沉淀可能会松弛 ，所以要缓慢倒掉上清。
9、加入1.5ml的70%乙醇，涡旋震荡5秒，2500×g离心5分钟，弃上清。
注意：如果沉淀贴壁不牢.可以适当延长离心时间或増大离心力。
10、把离心管倒置于干净的吸水纸上5分钟，确保沉淀在管中 。
注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。
11、空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净(至少5分钟)。
注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、 PCR等)实验，但避免过度干燥DNA沉淀，因过度干燥会使DNA难于溶解。
12、加入300μl的Buffer GE，低速涡旋5秒，65℃孵育1小时溶解DNA，期间轻弹数次助溶。一20℃保存DNA。
注意：如果DNA没有完全溶解，可室温过夜。如果使用少量的FG3溶解DNA，建议延长孵育时间。

三、从6～20ml全血中提取基因组(以10ml血液处理量为例)
1、取10ml全血于50ml离心管(自备)中，加入10ml Buffer FG1，上下颠倒混匀5次，2500×g离心5分钟。
2、再向离心管中加入15ml Buffer FG1，涡旋震荡，使沉淀完全分散。2500×g离心5分钟，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置2分钟。
注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。
3、按照附表配制缓冲液FG2与蛋白酶K 的混合液(比例100:1)。
注意：此混合液最好现用现配，井在配好后1小时之内用完。
4、加入5ml Buffer FG2/蛋白酶K 混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。
注意：
1)如果有多个样品同时操作，加入Buffer FG2/蛋白酶K 混合液后立即涡旋震荡，不要等所有样品都加完后再震荡。
2)通常涡旋震荡3-4次，毎次5秒可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋震荡后发现沉淀中含胶状物质可以再加入1ml BufferFG2/蛋白酶K 混合液，再次涡旋混匀。
5、65℃孵育30分钟，其间颠倒混匀数次。
注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿说明蛋白消化完全。
6、加入5ml导丙醇，上下颠倒彻底混匀直至看到DNA。
注意：与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要，应该至少上下颠倒离心管20次确保沉淀完全。
7、2500×g离心5分钟。
注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或増大离心力。
8、弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干。
注意：在管底可见白色的DNA沉淀，在极少情况下沉淀可能会松弛 ，所以要缓慢倒掉上清。
9、加入5ml的70%乙醇，涡旋震荡5秒，2500×g离心5分钟，弃上清。
注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或増大离心力。
10、把离心管倒置于干净的吸水纸上5分钟，确保沉淀在管中 。
注意：在极少情况下沉淀可能会松驰 ，所以要缓慢倒掉上清。
11、空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净(至少5分钟)。
注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、 PCR等)实验，但避免过度干燥DNA沉淀，因过度干燥会使DNA难于溶解。
12、加入1ml的Buffer GE，低速涡旋5秒，65℃孵育1小时溶解DNA，期间轻弹数次助溶。-20℃保存DNA。
注意：如果DNA没有完全溶解.可室温过夜。如果使用少量的FG3溶解DNA，建议延长孵育时间。

附表：不同体积血液所需各种缓冲液用量

缓冲液	血液样品的体积(μl)
	100	300	1000	3000	5000	10000	20000
Buffer FG1(μl)	250	750	2500	7500	12500	25000	50000
Buffer FG2(μl)	50	150	500	1500	2500	5000	10000
蛋白酶K(μl)	0.5	1.5	5	15	25	50	100
异丙醇(μl)	50	150	500	1500	2500	5000	10000
70%乙醇(μl)	50	150	500	1500	2500	5000	10000
Buffer GE(μl)	100	200	200	300	500	1000	1000
补加FG2和蛋白酶K 混合液	10	30	100	300	500	1000	1000

储存条件：室温(15～30℃)。


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·PBS(pH7.5,10×)
编号：WE0312
规格：500ml

·Tris-甘*酸转膜缓冲液(pH8.3,10×)
编号：WE0311
英文名称：Tris-Glycine Transfer Buffer(pH8.3, 10×)
规格：500ml

·生物素化驴抗人IgG(H+L)
编号：WE0371
英文名称：Donkey Anti-Human IgG,Biotin Conjugated
规格：100μl
本产品为生物素标记的经亲和纯化的驴抗体，特异识别人IgG重链和轻链，检测灵敏度高，本底低，对其他种属IgG无明显交叉反应。生物素(Biotin)与链霉亲和素(Streptavidin，SA)具有极高的亲和力，反应呈高度专一性。每个链霉亲和素分子具有4个生物素分子结合位点，因此，链霉亲和素可同时以多价形式结合生物素。生物素化的抗体与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素联合使用，将检测信号级联放大，最后通过显色反应或化学发光可检测到微量蛋白。

免疫原：人IgG
缓冲液：0.01M PBS，50%甘油，pH7.6
稳定剂：15 mg/ml BSA(不含IgG和蛋白酶)
防腐剂：0.05%叠氮*
应用范围：
WB 酶链亲和素检测(1：20000-400000)
ELISA(1：20000-400000)
Enzyme immunohisto/cytochemistry(1：500-5000)
Fluorescence Immunohisto/cytochemistry(1：200-1000)
Flow cytometry(1：200-1000)


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·6×DNA上样缓冲液
编号：WE0221
英文名称：6×DNA Loading Buffer
规格：10ml

·抗GAPDH单克隆抗体
编号：WE0356
英文名称：Anti GAPDH Mouse Monoclonal Antibody
规格：100μl
GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱*酶)是参与糖酵解的一种关键酶，由4个36kDa的亚基组成。除参与糖酵解外，有证据表明哺乳动物细胞中的GAPDH参与了多种胞内生化过程，包括膜融合(membrane fusion)、微管成束(microtubule bundling)、磷酸转移酶(phosphotransferase)激活、核内RNA出核、DNA复制与DNA修复等。GAPDH蛋白几乎在所有组织中都高水平表达，常用于Western Blot检测中校正系统的内参。

抗体类型：鼠单克隆抗体IgG
免疫原：纯化的GAPDH蛋白
应用范围：WB(1：500-5000)
应用种属：人、小鼠、大鼠、兔、猪，鸡、拟南芥

·无RNA酶水
编号：WE0217
英文名称：RNase-Free Water
规格：100ml
本品为不含RNase的水，常用于RNA的提取纯化、RT-PCR等分子生物学实验。

·HRP标记山羊抗人IgG(H+L)
编号：WE0375
英文名称：Goat Anti-Human IgG, HRP Conjugated
规格：100μl
本产品为辣根过氧化物酶标记的经亲和纯化的山羊抗体，特异识别人的IgG的重链和轻链，检测灵敏度高，本底低，对其他种属IgG 无明显交叉反应，可用于Western Blot、ELISA 和免疫组化检测。酶标记抗体，是一类广泛用于免疫学、分子生物学及临床医学各个分支学科中的免疫化学制剂，具有特异、敏感和安全的特点。

免疫原：人IgG
缓冲液：0.01M PBS，50%甘油，pH7.6
稳定剂：15 mg/ml BSA(不含IgG和蛋白酶)
防腐剂：无(叠氮*是HRP抑制剂，抗体稀释液中请避免使用叠氮*作为防腐剂)
应用范围：
WB(1：2000-10000)
ELISA(1：2000-20000)
Immunohisto/Cytochemistry(1：100-200)

我公司强烈推荐核酸扩增(PCR)系列产品，热情期待您的咨询选购一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量ROX校正染料)北京厂家。