- ￥2900
- Solarbio
- 北京
- BC3315
- 2025年07月08日
企业认证
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- 详细信息
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- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
6个月
- 英文名：
PEPCK Assay Kit
- 库存：
3-5天
- 供应商：
索莱宝
- CAS号：
BC3315-100T/96S
- 规格：
100T/96S
磷酸烯醇式丙*酸羧激酶（PEPCK）活性检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC3315
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
| 试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
| 提取液 |
液体110 mL×1瓶 |
2-8℃保存 |
| 试剂一 |
液体18 mL×1瓶 |
2-8℃保存 |
| 试剂二 |
粉剂×1瓶 |
-20℃保存 |
| 试剂三 |
液体18 μL×1支 |
2-8℃保存 |
| 试剂四 |
液体62 μL×1支 |
2-8℃保存 |
| 试剂五 |
粉剂×1瓶 |
-20℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前加入15 mL试剂一溶解。可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。
2、 试剂三：液体置于试剂瓶内EP管内。临用前加入蒸馏水按体积比1：120稀释，现用现配。
3、 试剂四：液体置于试剂瓶内EP管内。临用前加入蒸馏水按体积比7：250稀释，现用现配。
4、 试剂五：粉剂置于试剂瓶内玻璃管内。临用前加入2.5 mL蒸馏水充分溶解；可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。
5、 工作液的配制：将试剂二、试剂三、试剂四按7:1:1（V:V:V）的比例配制工作液，工作液现用现配。
产品说明：
PEPCK（EC 4.1.1.32）广泛存在于动物、开花植物、藻类、部分真菌和细菌中。该酶催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙*酸，是调节糖异生途径的第一限速酶。
PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙*酸和CO2，丙*酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心10min，取上清，置冰上待测。
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟。
3、 操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列试剂：
| 试剂名称 |
空白管 |
测定管 |
| 样本（µL） |
|
10 |
| 蒸馏水（µL） |
10 |
|
| 工作液（µL） |
180 |
180 |
| 试剂五（µL） |
10 |
10 |
| 加入试剂五后立即混匀，于340nm处测定10s时的吸光值A1和1min10s时的吸光值A2，计算ΔA测定管= A1测定-A2测定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管（空白管只需做1-2次）。 |
||
三、PEPCK酶活计算
A 按微量石英比色皿计算：
1、 按蛋白浓度计算
酶活定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 3215.4×ΔA÷Cpr
2、 按样本质量计算
酶活定义：每g组织每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK酶活（U/g 质量）= ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T=3215.4×ΔA÷W
3、 按细菌或细胞数量计算
酶活定义：每104个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK酶活（U/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（500×V样÷V样总）÷T=6.43×ΔA
4、 按血清（浆）体积计算
酶活定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK（U/mL）＝ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷V样÷T=3215.4×ΔA
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.0002L；V样：反应体系中样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g，T：反应时间：1min；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
B 按96孔UV板计算：
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。
注意事项：
1、 当A1小于1或ΔA大于0.6时（96孔UV板是当A1小于0.6或ΔA大于0.4时），建议将样本稀释适当倍数后再进行测定，以提高检测灵敏度。
2、 酶活性高的样本如动物肝、肾等组织，建议将提取液稀释5倍或5倍以上测定。
3、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.06。
4、 加样、混匀等步骤要迅速，秒表计时要准确。
实验实例：
1、 取0.1g肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后再用提取液稀释2倍，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管= A1测定-A2测定=1.1298-0.4464=0.6834，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.3819-1.3463=0.0356，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.6834-0.0356=0.6478，按样本质量计算酶活得：
PEPCK酶活（U/g质量）= 3215.4×ΔA÷W×2（稀释倍数）=3215.4×0.6478÷0.1×2=41658.72 U/g 质量。
2、 取0.1g芦荟加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管= A1测定-A2测定=1.4015-1.2665=0.135，ΔA空白管= A1空白-A2空白=1.3819-1.3463=0.0356，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.135-0.0356=0.0994，按样本质量计算酶活得：
PEPCK酶活（U/g质量）= 3215.4×ΔA÷W=3215.4×0.0994÷0.1=3196.108 U/g 质量。
相关系列产品：
BC0730/BC0735 丙*酸羧化酶（PC）活性检测试剂盒
BC0920/BC0925 果糖-1,6-二磷酸（酯）酶（FBP）活性检测试剂盒
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- 作者
- 内容
- 询问日期
文献和实验|
AuthorZhennan Zhan, Yanxia Zhang, Kangqi Geng, Xiaobin Xue, Alain Deloire, Dongmei Li, Zhenping Wang
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Publish_toFoods
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IF5.2000
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PMID
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（一）检测原理 血细胞比容（Hct、Ht、HCT或PCV）是指在一定条件下，经离心沉淀压紧的红细胞在全血样本中所占比值。 1、离心法：包括温氏法（Wintrobe法）、微量法：是将抗凝血置于孔径统一的温氏管或毛细玻管中，以一定转速离心一定时间后，计算红细胞层占全血的体积比。 2、血液分析仪法：原理是当细胞通过计数小孔时，形成相应大小的脉冲，脉冲的多少即为细胞数量，脉冲高度为细胞体积，通过红细胞平均体积（MCV）和红细胞计数（RBC）即求得血细胞比容，Hct=MCV×RBC
一致。三、间接凝集的分类 1、根据载体的不同，可分为间接炭凝、间接乳胶凝集和间接血凝等。2、根据吸附物不同可分为间接凝集反应（吸附抗原）和反向间接凝集反应（吸附抗体）。3、根据反应目的不同，又可分为间接凝集抑制反应和反向间接凝集抑制反应。4、根据用量和器材的不同又可分为试管法（全量法）、凹窝板法（半微量法）和反应板法（微量法）。
1、手工法：有折射计法、粘度法、比密测定法、离心法和放射性核素法。温氏法：采用中速离心，不能完全排除红细胞间残留血浆，测定结果偏高，已属淘汰。微量法：采用高速离心，细胞间残留血浆比温氏法少（约2%），且样本用量小、操作简便、残留血浆1%～3%。 2、血液分析仪法：仪器法CV为1%，手工法CV为2%，仪器法应注意红细胞增多症或血浆渗透压异常时会出现误差。
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