载体pGL3-U6-gRNA-PGK-Puro

常用载体元件介绍及病毒载体应用

1.常用载体分类：2,常用载体元件介绍：(1) 启动子：启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子主要分为广谱启动子和特异性启动子。广谱启动子为在各种组织、细胞上广泛表达的启动子；特异性启动子为在特异性组织或者细胞类型上表达的启动子。常用广谱启动子有CAG，CMV，EF1a，PGK等，还包含启动RNA的III型启动子U6和H1启动子；常用特异性启动子如成熟神经元特异性启动子hSyn，投射神经元特异性启动

CRISPR 技术进行细胞 TP53 基因敲除

：pCas9/gRNA1 载体本身不带筛选标签。我们用带有嘌呤霉素和 EGFP 标签的载体 pLV-EGFP（2A)puro 和 pCas9/gRNA1 载体共转染，再用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。 简要步骤 设计靶点→构建 pCas9/gRNA1 载体→pTYNE 验证靶点→pCas9/gRNA1 载体转染 293T 细胞→挑选培养细胞克隆→测序验证基因敲除 靶点设计和基因敲除载体构建 人 TP53 基因有多个 mRNA 和蛋白拷贝，2 个转录起始位点，以及多个

CRISPR-Cas9 全程实操教程：从 gRNA 设计到挑单克隆全程指导

的原件与表达 Cas9 的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行基因操作，在 PAM (5'-NGG) 上游～3bp 进行切割，如下图所示。因此本实验的关键步骤是设计一对 20bp（不包括 NGG 在内的）完全互补的 oligo 插入到如上图所示的 filler。另 U6 启动子需要 5' 端的 G 起始转录，因此若设计的 oligo 第一个碱基非 G，需额外增加一个 G。操作详细流程1. 设计 sgRNA关于 sgRNA 的设计我们有专门开过一篇文章《一文掌握