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- TBD
- 天津
- TBD1090CMAC
- 2025年07月11日
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- 英文名：
上海研谨生物科技
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大量供应
- 供应商：
上海研谨生物科技
- 规格：
2X200ml/Kit
产品编号：TBD1090CMAC
产品名称：鸡脏器组织巨噬细胞分离液KIT
产品规格：2X200ml/Kit
产品价格：￥1100.00元
本品用于分离鸡脏器组织巨噬细胞
“XXXX”动物肿瘤（脏器）组织巨噬细胞分离液实验方法
技术文档编号：TBD0052SOP
【产品规格】
2×200ml/Kit
【产品组成】
为方便广大用户使用，试剂内容如下：
| 名称 | 产品编号 | 规格 | |
| A | 分离液 1 | 200ml | |
| B | 分离液 2 | 200ml | |
| C | 样本稀释液（赠品） | 2010C1119 | 200ml |
| D | 清洗液（赠品） | 2010X1118 | 200ml |
| E | F 液（赠品） | F2013TBD | 200ml |
| F | 说明书 | 1 份 | |
【实验前准备】
适用仪器：最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机
【检验方法】
全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。
- 首先制备组织单细胞悬液，制备方法详见“组织单细胞悬液制备技术（文档编号：
TBD0004SOP）”。
- 取一支离心管，依次小心加入分离液 1、分离液 2（体积比为 3:1，试剂总量与细胞悬液体积比为 2：1。如细胞悬液为 2ml，则先后加入分离液 1：3ml、分离液 2：1ml。试剂总量最少不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。
- 用吸管小心吸取细胞悬液加于分离液液面上，500g，离心 25min（注：根据样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
- 离心后，此时离心管中由上至下分为六层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色巨噬细胞层（第一层白环及上层 50%分离液 2）。第三层为环状乳白色单个核细胞层（下层50%分离液 2 及第二层白环）。第四层为透明分离液 1 液层。第五层为粒细胞层。第六层为红细胞层。
- 用吸管小心吸取第二层到另一 15ml 离心管中，往所得离心管中加入 10ml 清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。
- 250g，离心 10min。
- 弃上清。
- 用吸管以 5-10ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。
- 250g，离心 10min。
- 重复 7、8、9，弃上清后以 0.5ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。
分离图例：
【差异贴壁法纯化细胞】
（1）用巨噬细胞无血清培养基（产品编号：TBD20180029）或巨噬细胞完全培养基（产
品编号 TBD20180059）以 1.5-3×106 个/ml 的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板
或细胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。
（2）2-4 小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。
（3）10-24 小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。
（4）不贴壁的为淋巴细胞。
注：
- 无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加 10%自体血浆或2-8% 经筛选的胎牛血清。
- 完全培养基中含 2-20%胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。
- 由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成
本相对较低。如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴
性分选。
【注意事项】
- 全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最好在取样 2h 内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
- 本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。
- 吸取过多的乳白色细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。
- 分离液用量大于组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。
- 如实验后细胞得率或活性过低，请联系技术支持以寻求帮助。
【储存条件及有效期】
常温保存，有效期 2 年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启
封后置常温保存。如 4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
【参考值（参考范围）】
本实验巨噬细胞提取率大于 80%。
下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。
| 红细胞 | 白细胞 | 血小板 | |||
| （4.0-10.0）×109 | |||||
| 含量（个/L） | （4.0-5.5）×1012 | 中性粒细胞 | 淋巴细胞 | 单核细胞 | （1.0-3.0）×1011 |
| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% | |||
| 【相关实验技术方案】 | |||||
- 组织单细胞悬液制备技术。
- 所获得巨噬细胞的培养技术。
- 所获得巨噬细胞的核酸提取技术。
- 所获得巨噬细胞的鉴定方法A.流式细胞技术
B.免疫组化技术
C.原位杂交技术
D.PCR 技术
【可能存在的问题及解决方法】
1. 由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：
| 出现情况 | 出现原因 | 建议解决方案 |
| 离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层 | 转速过小或离心时间过短 | 适当增减转速 |
| 离心后目的细胞存在于分离液中 | 转速过大或离心时间过长 | |
| 离心后白环层弥散 | 细胞密度过大 | 调整细胞密度 |
| 离心后白环层太浅或看不见 | 细胞密度过小 | |
- 本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离心时间，对离心转速进行调整。
- 本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。
注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以 50-100g 为基数，直至达到最佳分离效果，
离心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。
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文献和实验的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。 二、肿瘤细胞株的传代培养 传代细胞是指来自人或动物的肿瘤组织或正常组织的细胞，其染色体组型发展为非整倍体或二倍体低于75％，这种非整倍体细胞在体外具有无限传代的生命力，通常具有异种移植的能力和较广泛的病毒敏感性。传代细胞的特性是：①具恒定繁殖特性，少数细胞即有繁殖能力，在琼脂内能形成克隆；有的为贴壁生长，有的悬浮生长。②染色体组型为异倍体，大多数人源细胞染色体为60－70 条左右
Tris, 0.75%氯化铵，pH7.4)，37℃处理3～5分钟，溶解红细胞。红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1%和10%。也可以不用低渗处理，直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。 5.离心200×g 10分钟，去上清液。用RPMI-1640 培养液洗涤细胞一次。将细胞悬液加在淋巴细胞分离液(比重1.077)上，离心400×g 20分钟，收集交界面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。 6.用RPMI-1640培养液洗涤巨噬细胞2次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞
比妥麻醉动物。仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。以下过程注意无菌操作。小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。 2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。 3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI
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