BRAF Wild Type Reference Stand

FFPE

定义：FFPE或福尔马林固定和石蜡包埋是一种广泛用于分析基因表达的细胞组织的保存方法。FFPE样品可以在室温下储存，因此可以避免冷冻保存的复杂性和风险性。

预分析处理通常包括多个步骤，包括样品固定，DNA分离和定量。在这些阶段的每一步中，例如实验员之间的样本处理，仪器和方法之间的微小差异都可能会引起显著的变化，引起对DNA的质量和下游测定结果可靠性的怀疑。

• 福尔马林固定剂的使用源于其与蛋白质交联的能力，但也有报道声称其会诱导羟甲基修饰和酸介导的水解，这可能会混淆基因表型的分析。

• 提取步骤通常使用市售的试剂盒进行。厂商之间的差异，甚至来自同一厂商的不同批次之间的偏差都是常见的。

• 并非所有的实验室都会进行定量检测，但此步骤可确保DNA分离产物满足实验所需的最低浓度。定量仪器可能会无法区分低产出样本和片段化样本。

比较FFPE样品的DNA提取方法

从福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织中分离基因组DNA是分子诊断（MDx）的关键步骤。重要的是从FFPE组织中提取尽可能多的DNA并且其质量足以进行必要的MDx测定（例如QPCR，Sanger测序，Pyrosequencing™）。

订制版的FFPE细胞系合成可以用于研究从低细胞数量中回收最佳DNA产量和浓度的DNA提取试剂盒。使用五种对比的方法进行DNA提取：Promega Maxwell®16 FFPE Tissue LEV DNAPurification Kit; Promega MagneSil®Genomic, Fixed Tissue System Kit; Promega Relia Prep™FFPE gDNA MiniprepSystem;Qiagen DNeasyBlood & Tissue Kit;Roche Cobas®Sample Preparation Kit.

商品化和订制的参考资料

实验室通常认为一个失败的方法是由于分析步骤的失败而导致的，然而根源分析通常显示其失败是源于DNA提取或者定量（例如，高估DNA样品的浓度导致实验时样本加量不足）。

分析实验失败的原因对于不常处理FFPE组织或使用的定量方法偏高（比如用NanoDrop测量浓度低于20 ng/μl）的实验室来说是一个巨大的挑战。

为了满足这一需求，Horizon Diagnostics开发了一系列HDx™FFPE参考标准品，以确保整个实验流程的有效性。

通过定制参考标准品，我们可通过多种不同位点及规格来制定最好的参考标准品。

定制参考标准品

这些参考标准品高度稳定和可靠，并且产量与质量相同的DNA一致，使用户能够对比提取试剂盒及批次间差异。

图1.在工作流程中使用FFPE来质控变异性

FFPE参考 标准品的制备

B-Raf，EGFR，K-Ras和PI3Kα 精确定量FFPE分子参考标准品的开发

从福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织中分离出基因组DNA是许多分子诊断中的关键步骤。Horizon Diagnostics的FFPE参考标准品中含有明确的DNA量和等位基因突变频率，从而能够对DNA提取和测定灵敏度进行质控。

图2.FFPE切片的稳定性

在工作流程中应用参考标准品

FFPE DNA提取

参考标准品是由高度同源细胞产出的稳定且质量好的DNA。

实验室能够通过参考标准品的理论产量和标准比来比较和确定DNA提取的效率。实验室内不同方法的比较可以被视作一个可变的例子。来自Horizon的数据显示，当使用五种不同的方案从这些标准品中提取DNA时，可以观察到产量到产量的显著变化。

图3.来自参考标准品的DNA回收率

DNA定量

DNA提取后，必须准确定量FFPE DNA的产量，以便为下游测序文库的制备确定合适的起始量，并有助于了解等位基因突变频率的理论阈值（见下图）。

当样本浓度高于10 ng/μl时，虽然像UV/VIS这样的光谱方法能够进行可靠的定量，但荧光定量会具有更好的精确度和特异性（仅测量DNA）。

重要的是，定量的方法会影响最终的结果。

图4. 在多个实验室收集的测量数据中，通过Nanodrop分光光度法测量的DNA浓度与Qubit的荧光测定法测得浓度的比值之间存在显着差异

FFPE组织样品/质量控制

FFPE（福尔马林固定和石蜡包埋）是目前最为广泛使用的保存细胞组织并将其应用于随后的基因表达分析的方法。这主要是由于FFPE组织样本可以在室温下长期储存，因此避免了保存的复杂性和冻结风险。然而，FFPE组织样品也有几种已知的弊端，包括：片段化和化学修饰，使其在分子研究中具有挑战性。

此外，随后的预分析处理通常涉及多个步骤，包括样品固定，DNA分离和定量。在这些阶段中，类似于不同实验员之间对样本的处理，甚至仪器和方法之间这样的微小差异都会导致显着的变化，引起对DNA的质量和下游测定结果可靠性的质疑。

福尔马林固定和石蜡包埋样品的降解

来自Spencer et al, 2013的一个关于FFPE组织样品降解的例子显示，当将FFPE与冷冻样品进行比较时，来自FFPE样品的NGS数据显示其具有较小的文库插入片段大小，更大的覆盖变异性和CpG中的C较多的转为T，可能是由DNA的甲基化和福尔马林的诱变的相互作用引起的。

图1.来自福尔马林固定和新鲜冷冻组织标本的临床靶向NGS数据的比较 (Spencer 2013)

Hedegaard et al. (2014) 进一步表明，三个月的储藏会导致DNA的提取效率降低，主要因为：

• 高度片段化化：DNA的丢失

• 文库的复杂性降低

• PCR重复率高度增加，福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）样本为60 - 85％，新鲜冷冻（FF）样本仅为30％

FFPE DNA提取试剂盒的变异示例

如下图所示，除了已知的问题外，从FFPE的组织样品中提取DNA也成为许多实验室中挑战性的障碍。重要的是，必须准确的确定DNA产量，以便为下游测序文库的制备投入适量的原料，并且了解理论等位基因频率阈值。当样本浓度高于10 ng/μl时，虽然像UV/VIS这样的光谱方法能够进行可靠的定量，但荧光定量会具有更好的精确度和特异性（仅测量DNA）。

图示–反映FFPE参考标准品的理论产量的DNA回收率。Horizon的数据显示，当采用五种不同的方法从我们的参考标准品中提取DNA时，如下图所示观察到显著的产量差异。使用细胞系衍生的可再生参考标准品有助于确保患者样本的有效性。

当使用具有临床诊断级别的诸如QIAamp DSP DNA FFPE之类的组织试剂盒时，在确定方案之前需要优化特定参数。在优化阶段，使用性能良好的标准品来评估方案修改是如何影响DNA产量的。如上图所示，这样的一种产品是我们的FFPE参考标准品，是由高度同源的细胞产出的稳定、可重复的DNA。

高品质FFPE参考标准品

总而言之，众所周知FFPE组织样本可能在下游分析过程中引起问题，导致潜在的基因表型问题。因此，实验室应确保其FFPE处理和之后的DNA提取/ DNA质量尽可能达到一个较高的标准，可以产出较高质量的数据。样本的时间、保存方法和储存条件均会影响其质量。

FFPE产品适用于：

• Sanger和qPCR测序

• NGS