北京现货His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂供应

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北京百奥莱博科技有限公司专业生产供应北京现货His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂供应，产品信息：

类别：蛋白质研究

英文名：Ni-NTA Agarose Resin 6FF

产品名	产品编号	包装规格
His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂	SY0393	10ml

品牌：百奥莱博

编号：SY0393

规格：10ml

英文名：Ni-NTA Agarose Resin 6FF

Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni2+）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。此外，因其基质的耐压性（可耐受最高0.3 MPa的压力），该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化，可在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化。

基质（Matrix）：高度交联的6%琼脂糖凝胶

孔径（Bead size）：45-165µm

载量（Capacity）：＞40mg 6×His-tagged protein/ml 基质

耐压（Tolerance Pressuremax）：0.3MPa, 3bar

储存缓冲液：含20%乙醇的1×PBS

储存条件：4℃保存，有效期2年

使用方法

（一）纯化流程

1 缓冲液的准备

缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22µm或0.45µm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表2。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表3。

2 样品准备

2.1 细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达的蛋白纯化为例）

1）挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。

2）表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。

3）之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/ml。【注】：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。

4）将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10µg/ml RNase A和5µg/ml DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

5）收集上述澄清蛋白液至离心管中，10000rpm，4℃离心20-30min。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。

2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白

将细胞培养液转移至离心瓶，5000rpm离心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。

【注】：对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。

2.3 包涵体蛋白纯化（以细菌为例）

1）将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。

2）按照菌体：裂解液=1:10（w/v）的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。

3）将破碎液转移至离心管，10000rpm，4℃离心20-30min，去上清。可重复步骤2）和3）一次。

4）按照菌体：裂解液（含8M尿素）=1:10（w/v）的比例将包涵体充分悬浮。

5）变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

3 装柱

1）用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。

2）将树脂悬浮，小心地将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。

3）如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。

4）打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如达不到推荐的压力或流速，可以用所用泵的最大流速，这样也可以达到一个较好的装填效果。当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱体积的去离子水。标上柱床高度。【注】：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%。

5）关闭泵，关闭层析柱出口。

6）如使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。

7）将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。

8）将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如需要可重新调整分配器。

4 样品纯化

装柱后，可用各种常规的中压色谱系统，以AKTA使用为例进行说明：

1）将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞，连接至色谱系统中，打开下出口，将纯化柱连接到色谱系统中，注意旋紧。

2）3-5倍柱体积去离子水冲洗纯化柱。

3）至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。1ml规格预装柱推荐流速为1ml/min，5ml预装柱推荐流速为5ml/min。

4）利用泵或注射器上样，收集流出液，以便SDS-PAGE检测蛋白结合情况。【注】：若样品粘度增加，即使上样体积很少也会导致层析柱很大反压；上样量不要超过柱子的结合能力；大量样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。

5）Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。

【注】：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。

6）Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。

7）建议用更高浓度咪唑（如500mM）彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

5 SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

（二）在位清洗

当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa）或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗时，先把Ni2+脱掉，清洗结束后，将填料保存在20%乙醇中，后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类

使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液，接触时间为1-2h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。

2 去除离子作用结合的蛋白

使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

（三）填料再生

当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa），填料上面出现明显的污染，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。按照下面操作流程进行：

1）使用0.2M 醋酸溶液（含6M GuHCl）清洗2倍柱体积；

2）去离子水清洗5倍柱体积；

3）2%SDS清洗3倍柱体积；

4）去离子水清洗5倍柱体积；

5）乙醇清洗5倍柱体积；

6）去离子水清洗5倍柱体积；

7）100mM EDTA（pH 8.0）清洗5倍柱体积；

8）去离子水清洗5倍柱体积；

9）100mM NiSO4清洗5倍柱体积；

10）去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。

北京现货His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂供应专业优质供应商：北京百奥莱博科技有限公司

关键词：SY0393,His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂,Ni-NTA Agarose Resin 6FF

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编号	类别	名称
SY0639	一抗	兔抗β-Tubulin多克隆抗体
SY0565	探针标记及检测	罗丹明标记鬼笔环肽
SY0777	免疫检测	免疫染色用二抗稀释液
SY0375	蛋白质研究	15%预制胶，12孔
SY0140	报告基因检测	RXR-Luc荧光素酶报告基因质粒
SY0507	细胞凋亡与增殖	台盼蓝染色液(0.4%)
SY0117	报告基因检测	AP3-Luc荧光素酶报告基因质粒
SY0731	二抗	DyLight 405标记驴抗山羊IgG(H+L)
SY0463	蛋白质研究	多聚D-赖氨酸(分子量15万～30万)
SY0419	蛋白质研究	DEAE弱阴离子纯化预装柱，1ML
SY0264	RNA纯化	DEPC水(无DNase、RNase )
SY0120	报告基因检测	BMP-Luc荧光素酶报告基因质粒
SY0035	核酸扩增(PCR)	热启动PCR Master Mix(不含染料)
SY0240	报告基因检测	腔肠素n
SY0675	二抗	Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)F(ab)2片段
SY0406	蛋白质研究	5ml重力层析空柱
SY0315	蛋白质研究	RIPA裂解液(弱)
SY0436	蛋白质研究	人β-淀粉样多肽 1-42
SY0638	一抗	小鼠抗β-Tubulin单克隆抗体
SY0634	一抗	HRP标记小鼠抗β-actin单克隆抗体
SY0534	细胞分离液	细胞消化液
SY0725	二抗	DyLight 405标记驴抗兔IgG(H+L)
SY0294	核酸扩增(PCR)	耐热逆转录酶II
SY0155	报告基因检测	STAT3-GFP报告基因质粒

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